目的:構(gòu)建條件性胰島β細(xì)胞鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性絲氨酸蛋白激酶（calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase,CASK）基因敲除小鼠,為研究CASK基因在糖尿病發(fā)生中的機(jī)制提供動物模型。方法:將CASKloxp/-雌鼠與CASKloxp/Y雄鼠雜交,獲得基因型為CASKloxp/loxp雌鼠、CASKloxp/Y雄鼠;再讓條件性胰島β細(xì)胞特異性表達(dá)Cre重組酶雄鼠與CASKloxp/loxp雌鼠雜交獲得CASKloxP/YMIP-Cre雄鼠和CASKloxP/-MIP-Cre雌鼠。CASKloxP/YMIP-Cre基因型小鼠即為本實驗所需要構(gòu)建的模型小鼠。小鼠生后1～2周剪尾,通過PCR鑒定小鼠基因型,4～5周齡時腹腔注射他莫昔芬誘導(dǎo)Cre重組酶表達(dá)后,利用實時熒光定量PCR、蛋白質(zhì)印跡技術(shù)驗證CASK基因敲除效果。結(jié)果:從引進(jìn)這兩種小鼠開始,繁殖10個月,共獲得基因型為CASKloxP/YMIP-Cre的雄鼠28只,PCR結(jié)果證實小鼠基因型符合CASKloxP/YMIP-Cre。實時熒光定量PCR、蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示CASKloxP... 

【文章來源】：南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2019年09期 北大核心

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

表達(dá)Cre重組酶小鼠基因型鑒定FSgure2GenotypinRresultsofCrerecombinasemice

2結(jié)果2.1CASKloxp/-、CASKloxp/loxp、CASKloxp/Y、MIPCre、CASKloxp/-MIPCre和CASKloxp/YMIPCre小鼠繁殖及鑒定在獲得CASKloxp/-雜合子小鼠后（圖1A），與C57BL/6小鼠雜交，不斷擴(kuò)大CASKloxp/-小鼠、CASKloxp/Y小鼠數(shù)量，再將CASKloxp/-小鼠與CASKloxp/Y小鼠雜交，可獲得的基因型有CASKloxp/-、CASKloxp/loxp、CASKloxp/Y和野生型（C57BL/6），子代小鼠皮膚及毛發(fā)均為黑色，部分子代小鼠基因型鑒定結(jié)果如圖1B；MIPCre小鼠（黑色）和C57BL/6小鼠（黑色）雜交，可獲得Cre重組酶陽性小鼠（MIPCre小鼠）和Cre重組酶陰性小鼠，部分子代小鼠基因型鑒定結(jié)果如圖2；然后將CASKloxp/loxp雌鼠與MIPCre雄鼠雜交，可獲得的基因型有CASKloxp/-、CASKloxp/Y、CASKloxp/-MIPCre和CASKloxp/YMIPCre，部分子代小鼠基因型鑒定結(jié)果如圖3。2.2CASK基因敲除效果驗證KO小鼠胰島中CASKmRNA表達(dá)水平明顯低于WT小鼠（圖4A），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；KO小鼠胰島中CASK蛋白表達(dá)水平較WT小鼠明顯降低，半定量分析結(jié)果顯示敲除效率約64%（圖4B）。同時提取KO小鼠和WT小鼠的肝、腎、大腦、下丘腦等組織蛋白進(jìn)行Westernblot檢測，發(fā)現(xiàn)KO小鼠和WT小鼠在肝、腎等其他組織中的CASK蛋白表達(dá)水平無明顯差異（圖5）。2.3KO小鼠的體重檢測對正常飲食的KO小鼠和WT小鼠的體重進(jìn)行監(jiān)測（4~8周），結(jié)果顯示KO小鼠與WT小鼠相比，生長速度無明顯差異（圖6）。3討論CASK廣泛表達(dá)于腦、肝、肌肉、脂肪和胰腺等組

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]IL-1β、TNF-α和IFN-γ對小鼠胰島β細(xì)胞中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜的影響[J]. 孫春濤,薛麗華,朱子陽,張凡,楊瑞雪,袁雪雯,劉倩琦.  南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2016(07)
[2]促炎性細(xì)胞因子對大鼠胰島β細(xì)胞miR-29家族及抗凋亡蛋白表達(dá)水平的影響[J]. 陳瑋,殷荔,繆愛梅,倪世寧,朱子陽,劉倩琦.  南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2015(06)



本文編號：2947017