天然免疫是機(jī)體抵抗病原微生物入侵的一道有力屏障。功能正常的天然免疫能使機(jī)體長(zhǎng)期維持在比較健康的狀態(tài),而功能失調(diào)的天然免疫,則容易導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。免疫調(diào)節(jié)對(duì)維持正常的天然免疫功能至關(guān)重要。近年來(lái),關(guān)于天然免疫的調(diào)節(jié)一直都是研究人員感興趣的研究領(lǐng)域。TLRs是天然免疫細(xì)胞上表達(dá)的一類主要的模式識(shí)別受體,對(duì)TLRs信號(hào)通路的深入研究將有助于我們對(duì)天然免疫調(diào)節(jié)的全面認(rèn)識(shí)。本課題主要是在巨噬細(xì)胞中探討RasGRP3和Ca2+對(duì)TLRs觸發(fā)的免疫應(yīng)答強(qiáng)度的調(diào)節(jié)。第一部分RasGRP3負(fù)調(diào)巨噬細(xì)胞中TLRs觸發(fā)的IL-6的產(chǎn)生及其分子機(jī)制研究天然免疫在宿主抗感染免疫過(guò)程中發(fā)揮著不可替代的作用。當(dāng)有病原微生物入侵機(jī)體時(shí),天然免疫細(xì)胞會(huì)第一時(shí)間檢測(cè)到病原微生物入侵并啟動(dòng)抗感染免疫應(yīng)答。在我們的日常生活中,病原微生物無(wú)處不在,我們的皮膚、粘膜等組織時(shí)刻都會(huì)和病原微生物發(fā)生接觸,然而在我們體內(nèi),天然免疫細(xì)胞并不會(huì)每時(shí)每刻都對(duì)它們所監(jiān)測(cè)到的病原微生物啟動(dòng)抗感染免疫應(yīng)答。在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中,天然免疫細(xì)胞形成了一套非常完善的啟動(dòng)免疫應(yīng)答的準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)監(jiān)測(cè)到的病原微生物信號(hào)非常微弱時(shí),天然免疫細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生應(yīng)答；只... 

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

4模式圖顯示SOS和RasGRP根據(jù)刺激物濃度介導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)答的強(qiáng)度Figure1.3.4ModeofSOSandRasGRPmediatedstrengthofcellresponseaccording

用較低濃度的LPS、Poly (I:C)或CpG ODN刺激巨唾細(xì)胞時(shí)，其他細(xì)胞因子也均有一定程度的增加，如TOF-ct、IL-ip和iNOS等（如圖1.3.5a-c),只是3 DCtrl siRNA b DCtrl siRNA C DCtrl siRNA■ RasGRP3 siRNA ■ RasGRP3 siRNA ■ RasGRPS siRNA9" 200 iTNFa *** ^ 2001/1-1/3 互 150 飛iNOSh I . |i5。l ni M II 100 門■門■ I 100 I I 1 鬥| iI 50 [l|n| I I 5ol |n|n| I 叫門Ifll nsI LIfll I I oLI^JniMed LPS (l;C) CpG Med LPS (l:C)CpG Med LPS(l;C)CpG圖1.3.5在巨嗟細(xì)胞中敲低RasGRP3的表達(dá)促進(jìn)TNF-ot以及iNOS的產(chǎn)生Figure 1.3.5 Knockdown of RasGRP3 promotes TNFa, IL-ip and iNOSexpression in macrophages. Peritoneal macrophages were transiently transfected withcontrol (Ctrl) or RasGRPS-specific siRNAs for 48h. Cells were treated with 1 ng/mlLPS, 2.5 [xg/ml Poly (I:C) or 6 |ig/ml CpG ODN for 6h. Then mRNA levels of TNFa(a), IL-ip (b) and iNOS (c) were determined by Q-PCR. Data are representative ofthree technical repeats with mean士s.d. ns, not significant; *, P < 0.05; **，P < 0.01;***，尸 <0.001 (ANOVA).RasGRP3對(duì)這些細(xì)胞因子的影響沒(méi)有RasGRP3對(duì)IL-6的影響那么顯著。從而表明在較低濃度的刺激物作用下，RasGRP3主要能抑制巨嗟細(xì)胞中IL-6的產(chǎn)生。由于我們平時(shí)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所使用的刺激物的濃度(如100 ng/ml LPS)遠(yuǎn)高于正常生理?xiàng)l件下機(jī)體細(xì)胞所能接觸到的病原微生物的濃度

Poly (I:C)或CpG ODN作用下，過(guò)表達(dá)RasGRP3分子能顯著抑制巨嗟細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞系中IL-6的表達(dá)(如圖1.3.7b，c)。進(jìn)一步表明RasGRP3確實(shí)能在低濃度刺激物作用下負(fù)調(diào)TLRs觸發(fā)的IL-6的產(chǎn)生。3 b DMock C OMock■ RasGRPS _RasGRP3(5r\i *?*■* *** *** AC\C\^ *** *** ***w I' I f 1 { I jii I 1J 1*1 n2 < .n f 300ct 2 40 Eo ^ 1 廣] a 200 [-]o TO ^ 一tr g> 20 ^！B: Flag I i 門 -^00 Bp' ‘ Med LPS (l:C)CpG Med LPS (l:C)CpG圖1.3.7在巨唾細(xì)胞中過(guò)表達(dá)RasGRP3能抑制IL-6的產(chǎn)生Figure 1.3.7 RasGRPS inhibits IL-6 production in macrophages, (a-c) RAW264.7cells stably transfected with Flag-tagged RasGRP3 were examined for RasGRPSexpression by Western blot (a)，or treated with or without 1 ng/ml LPS, 2,5 jxg/ml Poly(I:C) or 6 |ig/ml CpG ODN for 6h (b，c). Then IL-6 mRNA levels and the IL-6 proteinswere examined by Q-PCR (b) and ELISA (c) respectively. Data in (b，c) arerepresentative of three technical repeats with mean士s.d. ns, ***，P < 0.001 (ANOVA).3.4 RasGRP3分子的活化依賴于PKC對(duì)RasGRP3第155位蘇氨酸的碟酸化以往的研究表明在B細(xì)胞中，BCR/Ras信號(hào)通路的活化依賴于PKC對(duì)RasGRP3第155位蘇氨酸的礎(chǔ)酸化[37，38]。所以我們就想看看在巨唾細(xì)胞中


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