發(fā)布時(shí)間：2020-12-11 21:52

　　目的：以基因重組的方法構(gòu)建人白細(xì)胞介素15（hIL-15）基因重組體，并在肝癌細(xì)胞BEL-7402中表達(dá)，為進(jìn)一步研究IL-15的功能及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。同時(shí)將構(gòu)建好的IL-15真核表達(dá)質(zhì)粒與HBsAg核酸疫苗共同免疫Babl／c小鼠，以觀(guān)察其對(duì)小鼠免疫應(yīng)答的影響。 方法：依據(jù)Genbank中人白細(xì)胞介素15cDNA的序列，結(jié)合表達(dá)載體的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)、合成一對(duì)IL-15基因序列特異性引物，從正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞中抽提總RNA作模板，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增得到人成熟IL-15的cDNA片段，然后將IL-15cDNA克隆入pGEM-T Easy Vector中，形成中介重組體PGEM-IL-15，經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序分析后，再亞克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1hisB上，構(gòu)建人IL-15的真核表達(dá)載體pcDNA3.1hisB-IL-15。通過(guò)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至BEL-7402細(xì)胞，G418加壓篩選，建立真核表達(dá)細(xì)胞株，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-15蛋白含量，用IL-15依賴(lài)細(xì)胞株CTLL-2細(xì)胞及MTT法檢測(cè)rhIL-15生物學(xué)活性。 同時(shí)，單以HBsAg核酸疫苗pcDNA3.... 

【文章來(lái)源】：中南大學(xué)湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

RT一PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳lanel:RT一PCR產(chǎn)物ane:mars

示其中3個(gè)菌落有目的片段的插入。電泳結(jié)果顯示兩條清晰的帶型，大分子量片段為載體DNA，小分子量片段與待插入片段的大小一致，見(jiàn)圖5。以上述質(zhì)粒作模板進(jìn)行PCR，均顯示有500bp大小的擴(kuò)增條帶，挑取經(jīng)酶切鑒定的重組克隆進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與己報(bào)道序列進(jìn)行比較，證實(shí)兩者序列一致。見(jiàn)圖6。提示中介重組體pGEM一IL一15的構(gòu)建成功。

落進(jìn)行擴(kuò)增，菌落PCR有3個(gè)可以看見(jiàn)約500bp大小的擴(kuò)增條帶，該細(xì)菌抽提質(zhì)粒DNA后，BamHI及EcoRI雙酶切釋放出500bP的小片斷，電泳結(jié)果見(jiàn)圖7。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]PCR簡(jiǎn)便快速篩選陽(yáng)性克隆[J]. 王安,趙明,丁廣治.  生物技術(shù)通訊. 2000(01)
[2]支氣管哮喘病人外周血單核/巨噬細(xì)胞IL-15的分泌水平[J]. 呂冬梅,黃瑾,呂春平.  中國(guó)病理生理雜志. 1999(07)



本文編號(hào)：2911264