一、研究背景和目的肉毒梭菌（Clostridium botulinum）是一種厭氧的、革蘭氏陽性的孢子形成菌,肉毒毒素（botulinum neurotoxin,BoNT）是由肉毒梭菌分泌的一種神經(jīng)毒素,是所發(fā)現(xiàn)的生物毒素和化學(xué)毒素中毒性最強(qiáng)的物質(zhì),它可以作用于周圍運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢,神經(jīng)肌肉接點(diǎn)即突觸處,抑制突觸前膜釋放神經(jīng)介質(zhì)-乙酰膽堿,從而引起肌肉松馳性麻痹[1]。食品污染、嬰兒腸道感染及傷口感染是引起人類肉毒毒素中毒的主要原因[2]。肉毒毒素共包含A-G七種血清型,A、B型是人類肉毒中毒的常見型別,E、F型偶爾引起食物中毒流行,C、D型則僅引起動(dòng)物中毒,G型極少見。各型肉毒毒素分子在結(jié)構(gòu)和功能上有很多相似的特點(diǎn)：均由重鏈（H鏈,相對(duì)分子質(zhì)量為100KD）和輕鏈（L鏈,相對(duì)分子質(zhì)量為50KD）組成,二者由1個(gè)二硫鍵連接。重鏈的羧基末端（Hc）,又稱為受體結(jié)合區(qū),它負(fù)責(zé)與靶細(xì)胞的結(jié)合；重鏈N端（HN結(jié)構(gòu)域）為一個(gè)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能區(qū)域,而輕鏈具有鋅離子肽鏈內(nèi)切酶活性。結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)和催化這3個(gè)功能區(qū)域呈線性排列,轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域位于中間[3]。催化區(qū)域?yàn)橛搔?螺旋和β-折疊組成的緊實(shí)的球形結(jié)構(gòu),轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域主... 

【文章來源】：南方醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
前言
    1 研究目的和意義
    2 肉毒毒素研究進(jìn)展
        2.1 毒素的來源和分布
        2.2 肉毒毒素的理化性質(zhì)和提取方法
        2.3 肉毒毒素結(jié)構(gòu)和作用方式
        2.4 BoNT檢測(cè)及預(yù)防
        2.5 肉毒毒素中毒特點(diǎn)和預(yù)防
第一章 A型肉毒毒素重鏈C末端保護(hù)性抗原的制備
    1.1 材料
        1.1.1 網(wǎng)上GeneBank檢索獲得A型肉毒毒素的蛋白序列及三維立體結(jié)構(gòu)
        1.1.2 DNASTAR蛋白分析軟件
        1.1.3 B細(xì)胞表位優(yōu)勢(shì)區(qū)域的平均抗原性指數(shù)（AI）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
        1.1.4 網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器分析系統(tǒng)ExPasy系統(tǒng)
    1.2 方法
        1.2.1 A型肉毒毒素重鏈C末端抗原表位的預(yù)測(cè)
        1.2.2 A型肉毒毒素重鏈C末端抗原多肽的合成
    1.3 結(jié)果
        1.3.1 A型肉毒毒素重鏈C末端抗原表位的預(yù)測(cè)
        1.3.2 合成多肽的質(zhì)譜分析結(jié)果
    1.4 討論
第二章 BoNT/A抗原表位單克隆抗體的制備與檢測(cè)
    2.1 材料
        2.1.1 主要試劑
        2.1.2 儀器設(shè)備
        2.1.3 細(xì)胞
        2.1.4 培養(yǎng)基和緩沖液
    2.2 方法
        2.2.1 多肽合成抗原的制備
        2.2.2 小鼠免疫
        2.2.3 飼養(yǎng)細(xì)胞的制備
        2.2.4 脾淋巴細(xì)胞的制備
        2.2.5 髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備
        2.2.6 細(xì)胞融合
        2.2.7 融合細(xì)胞的培養(yǎng)
        2.2.8 篩選（Screening）
        2.2.9 克隆（Cloning）
        2.2.10 體外擴(kuò)大培養(yǎng)
        2.2.11 細(xì)胞凍存
        2.2.12 小鼠腹水制備
        2.2.13 腹水抗體效價(jià)的測(cè)定
        2.2.14 亞類鑒定
        2.2.15 腹水抗體的純化
        2.2.16 抗體純度的鑒定
        2.2.17 蛋白絕對(duì)含量測(cè)定
        2.2.18 抗體效價(jià)測(cè)定
        2.2.19 抗體特異性檢測(cè)
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 細(xì)胞融合
        2.3.2 雜交瘤克隆化結(jié)果
        2.3.3 單抗分型
        2.3.4 抗體效價(jià)測(cè)定
        2.3.5 單抗純化結(jié)果
        2.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
        2.3.7 抗體特異性檢測(cè)
    2.4 討論
        2.4.1 融合和陽性株篩選
        2.4.2 關(guān)于單抗的純化方法
        2.4.3 肉毒毒素研究存在的問題
第三章 全文小結(jié)
參考文獻(xiàn)
英文縮略詞表
碩士期間完成的論文
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]A型肉毒毒素保護(hù)性抗原基因的克隆及其結(jié)構(gòu)分析[J]. 王慧,蔭俊,袁斌,何君,王忠澤.  生命科學(xué)研究. 2001(04)
[2]人DAO氨基酸序列片段B-細(xì)胞表位的多參數(shù)預(yù)測(cè)[J]. 陳興,王更銀,叢愛麗,張立,許素菊.  免疫學(xué)雜志. 2000(03)
[3]蛋白順序性抗原決定簇的多參數(shù)綜合預(yù)測(cè)[J]. 萬濤,孫濤,吳加金.  中國免疫學(xué)雜志. 1997(06)
[4]PCR 檢測(cè)產(chǎn) A、B、E、F 和 G 型肉毒神經(jīng)毒素梭菌的神經(jīng)毒素基因[J]. 王穎群,嚴(yán)共華,雷祚榮.  中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志. 1997(03)
[5]A new approach for B-cell epitope prediction in viral proteins[J]. 吳玉章,朱錫華.  Chinese Science Bulletin. 1995(09)
[6]治療用A型肉毒結(jié)晶毒素的研制及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立[J]. 王蔭椿,張暉,黃保國,戴壯.  生物制品學(xué)雜志. 1990(03)
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本文編號(hào)：2899199