研究目的 體外擴(kuò)增弓形蟲4個(gè)不同分離株侵入相關(guān)分子ROP1基因；構(gòu)建原核及真核表達(dá)重組質(zhì)粒并表達(dá)；用DNA免疫技術(shù)將真核重組質(zhì)粒pcROP1直接免疫小鼠，以了解ROP1基因的遺傳穩(wěn)定性；研究該基因體外表達(dá)產(chǎn)物的抗原性；觀察其在小鼠肌肉組織中的表達(dá)、所誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答、IFN-γ基因的協(xié)同免疫作用及對弓形蟲感染的保護(hù)性；探索弓形蟲DNA免疫新途徑，為弓形蟲病的免疫預(yù)防提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究內(nèi)容 包括ROP1基因重組質(zhì)粒構(gòu)建及其DNA免疫兩部分。方法 ①弓形蟲ROP1基因的體外擴(kuò)增、克隆及表達(dá) 從弓形蟲RH、ZS1、ZS2及GT1分離株速殖子基因組DNA中擴(kuò)增ROP1基因片段；構(gòu)建pUC18-ROP1重組質(zhì)粒，酶切及PCR鑒定。亞克隆法構(gòu)建pBV220-ROP1原核表達(dá)重組質(zhì)粒，經(jīng)溫度誘導(dǎo)在E.coli中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE及Western-blot分析；亞克隆法構(gòu)建pcDNA3-ROP1真核表達(dá)重組質(zhì)粒，脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染肝癌HEPG-2細(xì)胞株，用G418選擇培養(yǎng)，分別收集陽性細(xì)胞克隆培養(yǎng)上清及細(xì)胞，SDS-PAGE及Western-blot鑒定；構(gòu)建pcDNA3-IFN-γ重組質(zhì)粒。②pcROP1質(zhì)粒
【學(xué)位單位】：中山醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：1999
【中圖分類】：R383
【部分圖文】：

.弓形蟲ROPI基因的體外擴(kuò)增及克隆圖1一1弓形蟲4個(gè)分離株基因組DNAI%瓊脂搪凝膠電泳圖譜Fig.l一1ThegenomieDNAorfm4ToJ詳polasn.agnodiisiolatesinl%agaorsesge，eletrophoCSr達(dá)入DNAjHindlll+EeoR1Markers2.IUIisolate3.251isolate4.252isolate5.GTIisolate圖1一弓形蟲4個(gè)分離株ROPI基因PCR擴(kuò)增1%瓊脂糖凝膠電泳圖譜Figl一An一plinedRoplgenearfgmentrfom4TDSxpolasJ”a了nodii壇olates畝nl../agaosresgelele吸orphocsrisRH150!ate2

Fig.l一1ThegenomieDNAorfm4ToJ詳polasn.agnodiisiolatesinl%agaorsesge，eletrophoCSr達(dá)入DNAjHindlll+EeoR1Markers2.IUIisolate3.251isolate4.252isolate5.GTIisolate圖1一弓形蟲4個(gè)分離株ROPI基因PCR擴(kuò)增1%瓊脂糖凝膠電泳圖譜Figl一An一plinedRoplgenearfgmentrfom4TDSxpolasJ”a了nodii壇olates畝nl../agaosresgelele吸orphocsrisRH150!ate2.251isolate3.252isolate4.GTI150!ate5.PCRMakrers74

I重組質(zhì)粒的酶切及PCR鑒定1%瓊脂糖凝膠電泳ionofreeombinantPlasmidPUC18一ROPIbyrestrietiveenzymesdigestionanleletroPhores石sEeoR1Markers2.PUC18PlasmiddigestedbyEeoRI\BamH13.PUCzs一C18一ROPIdigestedbyEeoRIB\amH15.AmPlifiedrfagmentrfom252gedearfgmentorfmPUC18一ROPI7.PCRMarkers75
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2889298