乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的生活周期可以分成以下幾個(gè)階段：病毒黏附宿主細(xì)胞；病毒穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞；釋放病毒基因組；表達(dá)病毒基因產(chǎn)物；復(fù)制病毒基因組；組裝病毒病毒顆粒；釋放病毒。與其它大部分病毒不同，HBV基因組還會(huì)從細(xì)胞漿穿越核膜進(jìn)入細(xì)胞核。HBV細(xì)胞核轉(zhuǎn)位機(jī)制包括HBV從胞漿進(jìn)入胞核和從胞核進(jìn)入胞漿兩個(gè)方面，有關(guān)這方面的研究已有二十余年，但仍未能形成統(tǒng)一見(jiàn)解。主要的焦點(diǎn)是HBV核衣殼是否進(jìn)入細(xì)胞核。Kamimura，Mc Caul TF、Yamaguchi等通過(guò)電鏡技術(shù)，發(fā)現(xiàn)HBV核衣殼可以通過(guò)細(xì)胞核孔從細(xì)胞核內(nèi)移行到細(xì)胞漿中，并且發(fā)現(xiàn)核衣殼絕大多數(shù)定位在細(xì)胞核內(nèi)，在胞漿中極少。核衣殼從細(xì)胞核到細(xì)胞漿的轉(zhuǎn)位是通過(guò)細(xì)胞核孔；轉(zhuǎn)位位點(diǎn)位于細(xì)胞核孔中心。與上述報(bào)道有分歧的研究認(rèn)為，核孔直徑最大只有25nm,而核衣殼直徑在30～35nm，因此核衣殼直接通過(guò)核孔的可能性不大，Guiddtti LG等報(bào)道核心蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠肝細(xì)胞中，核衣殼絕大部分定位在細(xì)胞核中，只有當(dāng)肝細(xì)胞處于有絲分裂期時(shí)，核衣殼才能從核內(nèi)轉(zhuǎn)到胞漿中，他們研究發(fā)現(xiàn)無(wú)論從胞核到胞漿，還是從胞漿到胞核，HBV核衣殼均不能穿越。HBV基因組核轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核是HBV在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的重要環(huán)節(jié)。本研究第一部分采用細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)和同位素示蹤技術(shù)分析HBV核衣殼蛋白、基因組在HBV侵入肝細(xì)胞過(guò)程中的定位及動(dòng)態(tài)變化，并闡明在HBV穿越細(xì)胞核膜過(guò)程中，核衣殼蛋白是否需要先蛻去這個(gè)問(wèn)題。 HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular，cccDNA)是HBV復(fù)制過(guò) 程中最為關(guān)鍵的中間體形態(tài)。HBV基因組在聚合酶作用下將部分雙鏈開(kāi)環(huán)結(jié)構(gòu) 補(bǔ)足成完整雙鏈開(kāi)環(huán)結(jié)構(gòu)，然后在細(xì)胞核內(nèi)連接酶作用下把雙鏈中原先存在的缺 口補(bǔ)平，形成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)，也就是cccDNA。HBV cccDNA在細(xì)胞 核內(nèi)RNA聚合酶作用下，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生多種RNA，其中中間體RNA是形成子代HBV Dane顆粒前提RNA。從病毒生活周期分析，HBV cccDNA是病毒復(fù)制以及致病 機(jī)理的關(guān)鍵所在。此外，HBV cccDNA可與細(xì)胞核內(nèi)的核蛋白結(jié)合，形成穩(wěn)定 的微染色體(mini一chromosome)結(jié)構(gòu)，抗病毒藥物很難清除它。由于肝細(xì)胞往 往處在細(xì)胞復(fù)制周期的G。期，降解HBV cccDNA很難，所以它的自然半衰期就 比較長(zhǎng)。除HBV基因組整合外，目前臨床應(yīng)用的抗HBV藥物和正在研究的治 療乙肝藥物的最迫切需要解決的就是消除HBV cccDNA，但是目前沒(méi)有便捷、 準(zhǔn)確、靈敏度高的方法可以供臨床動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)HBV cccDNA。Southen blot是檢測(cè) HBV cccDNA的經(jīng)典方法，但是該方法過(guò)程比較復(fù)雜，操作可控性比較差，而且靈 敏度不高。Addison等發(fā)展了一種能相對(duì)定量DHBV的競(jìng)爭(zhēng)PCR方法，雖然該 方法靈敏度有了提高，但是在整個(gè)操作過(guò)程中仍需進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜和32P標(biāo) 記的同位素探針雜交。PCR技術(shù)是非常靈敏、便捷的方法，但是由于HBV ccoDNA 與其它HBV DNA形態(tài)非常接近，很難設(shè)計(jì)出僅僅擴(kuò)增HBV。 ccDNA而不擴(kuò)增 其它HBV DNA的PCR方法。 本研究第二部分設(shè)計(jì)了一條特殊的嵌合引物，在該引物的5’端加入與HBV 基因組無(wú)關(guān)的序列，在通過(guò)一次單鏈延伸反應(yīng)和一次實(shí)時(shí)熒光定量PCR程序， 成功把HBV。ccDNA和非cccDNA形態(tài)的其它HBV開(kāi)環(huán)DNA結(jié)構(gòu)區(qū)分開(kāi)，并 通過(guò)熒光探針雜交，實(shí)現(xiàn)高靈敏度、實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。 論文一乙型肝炎病毒細(xì)胞核轉(zhuǎn)位動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè) 一、HBV短期感染細(xì)胞制備 為研究HBV生活周期中病毒細(xì)胞核轉(zhuǎn)位過(guò)程，需建立HBV感染細(xì)胞模型。HepGZ 細(xì)胞是人肝癌細(xì)胞株，無(wú)HBV基因組污染，生長(zhǎng)速度快。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在DMSO 和一些細(xì)胞因子存在下，可以增強(qiáng)對(duì)HBV易感性，并且更適合HBV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制 和表達(dá)。 HepGZ細(xì)胞長(zhǎng)至細(xì)胞培養(yǎng)瓶80%面積時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞收集，并將細(xì)胞濃度調(diào) 節(jié)至5 X 10‘細(xì)胞/m1，然后以每孔Zml加入到6孔板培養(yǎng)。24小時(shí)后，換新培養(yǎng) 基(DMEM、5%FCS、1 .5%DMSO、66nM胰島素、70 pM氫化可的松，l愉用新配) 2ml，培養(yǎng)24小時(shí)。丟棄上清液，加入HBV DNA陽(yáng)性血清(HBV DNA載量調(diào)節(jié)至 5 xlo，拷貝/ml)。12小時(shí)后，吸棄上清。用DMEM培養(yǎng)基洗滌5次。加入培養(yǎng)基 (DMEM、5%FCS、1 .5%DMSO、66nM胰島素、70 pM氫化可的松，臨用新配)2ml。 間隔24小時(shí)，吸取上清，并補(bǔ)加新培養(yǎng)基。吸取的上清作HBV相關(guān)標(biāo)志物動(dòng)態(tài) 監(jiān)測(cè)。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)培養(yǎng)上清中HBV DNA載量，方法參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。 放射免疫測(cè)定(RIA)培養(yǎng)上清液中HBsAg、HbeAg，操作方法參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。 免疫組化分析細(xì)胞HBcAg表達(dá)。HBV DNA陽(yáng)性血清(5 X IJc叩ies/ml)感染 經(jīng)DMSO、胰島素、氫化可的松處理的HePGZ細(xì)胞后48小時(shí)，細(xì)胞分泌的HBV Dane達(dá)到最高值，為8.96x 10污copies/m1，此后逐漸減少，第5天僅為 7.98x 10飛oPies/ml，接近本底水平，。細(xì)胞分泌的HBv相關(guān)抗原也在感染后48小時(shí)， 達(dá)到高峰，HBsAg CPM值最高達(dá)1 750，逐漸降低，至第4天已接近臨界水平。 HBeAg CPM值最高達(dá)1 325，逐漸降低，至第4天己接近臨界水平。免疫組化結(jié) 果，在感染細(xì)胞中可以找到HBcAg陽(yáng)性的細(xì)胞，在胞漿和胞核均有分布，主要 集中在細(xì)胞核
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類(lèi)】：R373
【文章目錄】：
一、 中文摘要
二、 英文摘要
三、 正文
    論文一 乙型肝炎病毒細(xì)胞核轉(zhuǎn)位動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)
        實(shí)驗(yàn)材料
        實(shí)驗(yàn)方法
        實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        討論
        結(jié)論
        參考文獻(xiàn)
    論文二 乙型肝炎病毒cccDNA熒光定量PCR檢測(cè)體系建立及應(yīng)用
        實(shí)驗(yàn)材料
        實(shí)驗(yàn)方法
        實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        討論
        結(jié)論
        參考文獻(xiàn)
四、 綜述
五、 附錄
六、 致謝

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本文編號(hào)：2889259