選題背景： 近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，多種分子生物學(xué)技術(shù)如P C R指紋分型，擴(kuò)增性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，核糖體r D NA序列分析，多位點(diǎn)序列分型等相繼用于隱球菌的分子流行病學(xué)及遺傳多態(tài)性研究，極大地促進(jìn)了人類對(duì)新生隱球菌遺傳多態(tài)性的認(rèn)識(shí)，增強(qiáng)了尋找致病線索的信心。通過(guò)分子生物學(xué)基因分型的方法了解各地流行的隱球菌基因型，對(duì)明確隱球菌的發(fā)病機(jī)制及流行趨勢(shì)有著深遠(yuǎn)的意義。 采用適當(dāng)?shù)姆肿由飳W(xué)分析方法對(duì)臨床隱球菌感染患者體液中分離出的菌株進(jìn)行基因分型，有助于了解我國(guó)臨床隱球菌的分子流行病學(xué)特征并監(jiān)測(cè)各基因型的變遷情況。結(jié)合隱球菌臨床分離株對(duì)常見抗真菌藥物的敏感性和臨床患者的臨床表現(xiàn)、治療效果及預(yù)后，以揭示基因型、體外藥敏實(shí)驗(yàn)和臨床治療之間的關(guān)聯(lián)。本課題分析了61株隱球菌臨床分離株的基因型和對(duì)兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、氟胞嘧啶的體外藥物敏感性，分析了基因型和體外藥敏的關(guān)聯(lián)。 另外，如何更早更準(zhǔn)確的明確隱球菌病的診斷對(duì)于臨床早期開展抗真菌治療和改善臨床預(yù)后至今仍是目前臨床診療亟需解決的眾多問(wèn)題之一，本課題還嘗試結(jié)合隱球菌特異性基因和目前已有的分子技術(shù)方法中，尋求新的更快速的診斷方法。 研究目的： 1.分析1993-2009年分離自我國(guó)臨床感染患者的61株隱球菌的基因型組成 2.觀察61株隱球菌臨床株對(duì)兩性霉素B、伊曲康唑、氟康唑、氟胞嘧啶的體外藥物敏感性； 3.分析不同種屬、不同基因型的隱球菌對(duì)藥物敏感性的差異； 4.基于隱球菌H99的IGS1基因序列，結(jié)合LAMP技術(shù)，快速特異的診斷隱球菌感染。 研究方法：1多位點(diǎn)基因序列分析及基因分型多位點(diǎn)基因序列分析：對(duì)61株隱球菌臨床株的IGS1和CAP59基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序、序列分析；將各隱球菌臨床株鑒定至基因亞型。 2.觀察隱球菌臨床株對(duì)常見抗真菌藥物的敏感性 用美國(guó)CLSI的M27A2微量稀釋法對(duì)61株隱球菌臨床株進(jìn)行常見抗真菌藥物兩性霉素B、伊曲康唑、氟康唑、氟胞嘧啶的藥敏實(shí)驗(yàn)。 3.比較不同基因型的隱球菌臨床株對(duì)常見抗真菌藥物敏感性的差異 4，構(gòu)建新的快速、特異、敏感的方法以檢測(cè)隱球菌 基于新生隱球菌H99的IGS1序列，利用LAMP(環(huán)等溫介導(dǎo)擴(kuò)增)方法，通過(guò)檢測(cè)隱球菌不同基因型的菌株和其他常見真菌驗(yàn)證其特異性，根據(jù)可檢測(cè)出的最小DNA濃度判斷其敏感性。 結(jié)果： 1.多位點(diǎn)基因序列分析及基因分型 分離自臨床感染患者的61株隱球菌臨床株中，45株（73.77%）為VNI基因型菌株；5株（8.20％）為VN II基因型菌株；2株（3.28％）為VN III基因型菌株；；14株（14.75％）為VGI基因型。 IGS1基因結(jié)合CAP59基因序列分析可以明確的將各臨床株鑒定至基因型水平。 2.觀察隱球菌臨床株對(duì)常見抗真菌藥物的敏感性 61株隱球菌臨床分離株對(duì)兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、氟胞嘧啶均敏感，最小抑菌濃度范圍分別為0.0625~1μg/ml，0.313-4μg/ml,0.125~16μg/ml0.125~8μg/ml,MIC90分別為1μg/ml，0.25μg/ml，4μg/ml，4μg/ml。 3.不同基因型的隱球菌臨床株對(duì)常見抗真菌藥物敏感性的差異（1）47株從非HIV感染患者體液中分離得到的菌株對(duì)氟康唑的MIC濃度為0.125-4μg/Ml，其幾何平均數(shù)為1.1589μg/Ml；而14株來(lái)自HIV感染患者的臨床分離株對(duì)氟康唑MIC濃度為0.5-16μg/Ml，其幾何平均值為3.1228μg/Ml；其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.001）。（2）47株從非HIV感染患者體液中分離得到的菌株對(duì)氟胞嘧啶的MIC濃度為0.125-4μg/Ml，其幾何平均數(shù)為1.4038μg/Ml；而14株來(lái)自HIV感染患者的臨床分離株對(duì)氟康唑MIC濃度為0.5-8μg/Ml，其幾何平均值為2.9720μg/Ml；其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.001）。 （3）新生隱球菌對(duì)兩性霉素B，伊曲康唑、氟康唑、氟胞嘧啶的MIC濃度分別為0.0625-1μg/Ml，0.313-4μg/Ml,0.125-16μg/Ml.0.125-8μg/Ml。格特隱球菌對(duì)這四種抗真菌藥物MIC濃度為0.125-1μg/Ml,0.0313-0.5μg/Ml，0.5-4μg/Ml,0.5-4μg/Ml。從種間差異分析，新生隱球菌和格特隱球菌對(duì)于這四種抗真菌藥物的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 （4）從基因型分類角度，基因型VNⅠ對(duì)兩性霉素B、伊曲康唑、氟康唑、氟胞嘧啶MIC幾何平均值分別為0.5156μg/Ml,0.1122μg/Ml,1.3608μg/Ml,1.6371μg/Ml；而基因型VGⅠ則分別為0.6300μg/Ml,0.1072μg/Ml,1.8517μg/Ml,1.8517μg/Ml。這兩種基因型的隱球菌對(duì)兩性霉素B、伊曲康唑、氟康唑、氟胞嘧啶的MIC均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由于在基因型VNⅠ的菌株中有部分菌株來(lái)自于HIV感染陽(yáng)性的患者，為了盡可能減少干擾因素，我們將基因型VNⅠ菌株中來(lái)自于HIV感染患者的菌株去除后，再次與基因型VGⅠ菌株分別就兩性霉素B、伊曲康唑、氟康唑、氟胞嘧啶再次做Student’s比較，結(jié)果依然無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 4，構(gòu)建新的快速、特異、敏感的方法以檢測(cè)隱球菌 基于IGS1序列設(shè)計(jì)的引物在LAMP反應(yīng)體系具有良好的特異性，除了新生隱球菌和格特隱球菌八個(gè)基因型出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果外，其他菌株包括勞倫特隱球菌、淺白隱球菌、淺黃隱球菌、土生隱球菌、指甲隱球菌、瘦弱隱球菌、斯金納隱球菌、念珠菌屬中的白念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌、毛孢子菌等均未出現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)。 基于新生隱球菌H99的核糖體內(nèi)基因間隔區(qū)IGS序列的LAMP敏感程度可以達(dá)到0.002fg（即10-6ng）。 結(jié)論： 1.分離自我國(guó)臨床患者的隱球菌臨床株以VN I基因型菌株為主；分離自AIDS患者的臨床株亦以VN I基因型菌株為主，2.我國(guó)的隱球菌臨床株絕大部分對(duì)常見抗真菌藥兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、氟胞嘧啶均敏感，存在個(gè)別菌株對(duì)兩性霉素B的敏感性下降，可能與臨床上治療接觸該藥有關(guān)系，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究探討；3隱球菌各基因型對(duì)這四種抗真菌藥物的體外藥敏無(wú)顯著差異；4，來(lái)源于HIV陰性患者的臨床株比來(lái)源HIV陽(yáng)性的菌株對(duì)氟康唑和氟胞嘧啶更為敏感；5基于IGS1序列設(shè)計(jì)的引物在LAMP反應(yīng)體系具有良好的特異性和敏感性，能夠快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的鑒定新生隱球菌和格特隱球菌，可以進(jìn)一步研究將該法應(yīng)用于臨床的隱球菌感染早期診斷技術(shù)之一。
【學(xué)位單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R3416
【文章目錄】：
摘要
Abstract
中英文縮略詞對(duì)照表
前言
第一部分 隱球菌臨床株 IGS 及 CAP59 基因序列分析及基因分型
    引言
    主要試驗(yàn)材料及設(shè)備
    實(shí)驗(yàn)方法
    結(jié)果
第二部分 隱球菌臨床株體外抗真菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)及與基因型關(guān)系
    引言
    主要試驗(yàn)材料及設(shè)備
    實(shí)驗(yàn)方法
    結(jié)果
    討論
第三部分 LMAP 法快速檢測(cè)隱球菌
    主要實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備
    實(shí)驗(yàn)方法
    結(jié)果
    討論
全文總結(jié)
文獻(xiàn)綜述
附錄一
附錄二
參考文獻(xiàn)
發(fā)表論文與科研工作
致謝

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 陳敏;唐永;潘煒華;廖萬(wàn)清;;獲得性免疫缺陷綜合征患者的新生隱球菌基因多態(tài)性研究[J];微生物與感染;2009年03期

2 潘煒華;廖萬(wàn)清;溫海;趙瑾;Ferry Hagen;Teun Boekhout;;利用微衛(wèi)星標(biāo)記研究新生隱球菌分子流行病學(xué)[J];中國(guó)真菌學(xué)雜志;2011年05期

3 車付彬;朱定衡;趙瑾;陳江漢;;我國(guó)新生隱球菌臨床株基因型分析[J];微生物學(xué)通報(bào);2009年09期

本文編號(hào)：2889115