人類基因組計劃是生命科學(xué)領(lǐng)域的一項跨世紀(jì)工程,目的在于獲得人類的全部基因組信息,揭示人類生命的奧秘及疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律,最終探索出疾病診治的有效方法。隨著分子生物學(xué)和計算機(jī)技術(shù)、生物信息學(xué)的發(fā)展,大規(guī)模測序已成為揭示細(xì)胞基因表達(dá)譜和發(fā)現(xiàn)新分子的有效手段。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells, DC)為體內(nèi)重要的專職抗原提呈細(xì)胞(APC),是機(jī)體T細(xì)胞特異免疫應(yīng)答的直接啟動和調(diào)控者。近年來,樹突狀細(xì)胞的分化發(fā)育、抗原加工提呈機(jī)理及其在腫瘤、感染、自身免疫性疾病和移植排斥中的作用已經(jīng)成為免疫學(xué)的前沿領(lǐng)域,從樹突狀細(xì)胞中尋找免疫新分子是目前免疫學(xué)領(lǐng)域的一大研究熱點。為了深入認(rèn)識DC的生物學(xué)功能,闡明其生物學(xué)作用的分子機(jī)理,我們在以往樹突狀細(xì)胞研究工作的基礎(chǔ)上,建立了人樹突狀細(xì)胞cDNA基因文庫的大規(guī)模隨機(jī)測序體系,以期尋找和發(fā)現(xiàn)具有我國自己知識產(chǎn)權(quán)的免疫新分子。 一.人樹突狀細(xì)胞cDNA質(zhì)粒文庫的構(gòu)建及其大規(guī)模測序體系的建立 用重組人GM-CSF和IL-4培養(yǎng)健康成人外周血單核細(xì)胞,獲取單核細(xì)胞來源的人樹突狀細(xì)胞。收集培養(yǎng)至第7天的懸浮細(xì)胞,FACS檢測顯示其表達(dá)樹突狀細(xì)胞特異性標(biāo)志CD1a及CD83,此外高表達(dá)HLA-A,B,C、HLA-DR、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD40和CD54等免疫分子,而單核細(xì)胞特異性標(biāo)志CD14幾乎不表達(dá)(5%),細(xì)胞純度達(dá)90%以上;同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)顯示其能顯著刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖,表明所獲得的樹突狀細(xì)胞純度高并具有免疫刺激活性。從2×107人樹突狀細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA 200μg,經(jīng)兩次磁珠選擇方法純化poly A+ RNA,獲得5μg mRNA。對純化的mRNA分別進(jìn)行人樹突狀細(xì)胞特異表達(dá)的趨化因子DC-CK1和膜表面標(biāo)記分子DEC205(6928bp)的RT-PCR和5’端的cDNA末端的快速擴(kuò)增(RACE)分析,表明mRNA群體中含有這兩種樹突狀細(xì)胞特異表達(dá)的全長分子。取4μg人樹突狀細(xì)胞mRNA,采用Life Technologies公司的SuperscriptTM質(zhì)粒文庫試劑盒,構(gòu)建人樹突狀細(xì)胞的cDNA質(zhì)粒文庫。mRNA在NotI-Oligo dT的引導(dǎo)下合成第一鏈,第二鏈合成后,末端加上SalI適配子,經(jīng)NotI酶切后,定向插入pSPROT2載體,經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B,原始文庫經(jīng)半固體培養(yǎng)后-80°C保存。經(jīng)SalI/NotI酶切鑒定分析,
【學(xué)位單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：1999
【中圖分類】：R392
【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
第一部分 人樹突狀細(xì)胞cDNA 基因文庫的建立及其大規(guī)模隨機(jī)測序體系的建立
第二部分 人樹突狀細(xì)胞cDNA 文庫隨機(jī)測序結(jié)果的分析及新分子的克隆
第三部分 新型細(xì)胞因子CX1 全長cDNA 的克隆及其表達(dá)確證
第四部分 細(xì)胞因子CX1 的重組表達(dá)及其活性研究
第五部分 細(xì)胞因子CX1 原核分泌表達(dá)的研究
小結(jié)
致謝
附錄
綜述

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳竺,李偉俞,曼熊慧,陳賽娟;人類基因組計劃的機(jī)遇和挑戰(zhàn):Ⅰ.從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)到功能基因組學(xué)[J];生命的化學(xué);1998年05期

2 朱學(xué)軍,曹雪濤,于益芝,陳國友,萬濤,馬施華,唐華,章衛(wèi)平;人外周血樹突狀細(xì)胞的體外擴(kuò)增及鑒定[J];中國腫瘤生物治療雜志;1997年04期

3 曹雪濤;樹突狀細(xì)胞的基礎(chǔ)與臨床研究新進(jìn)展[J];中國免疫學(xué)雜志;1998年03期

4 章衛(wèi)平,曹雪濤,萬濤,朱學(xué)軍,袁正隆,何龍;人樹突狀細(xì)胞cDNA質(zhì)粒文庫的構(gòu)建及其大規(guī)模隨機(jī)測序體系的建立[J];中國免疫學(xué)雜志;1999年06期

本文編號：2889011