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人胎兒表皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、基因轉(zhuǎn)染及向毛囊的定向分化

發(fā)布時(shí)間：2020-11-17 02:00

　　一．研究背景盡早封閉創(chuàng)面并最大可能地恢復(fù)功能與外觀是燒傷治療的主要目標(biāo)，目前臨床上治療燒傷廣泛采用的斷層自體皮片移植法面臨著自體皮源不足、增加創(chuàng)面面積、移植的皮膚攣縮及無皮膚附件等難題。皮膚組織工程技術(shù)為燒傷創(chuàng)面的修復(fù)提供了新的方法，以培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞膜片或自體刃厚皮片為表皮層，以人工合成的真皮接種成纖維細(xì)胞或異體／異種脫細(xì)胞真皮為真皮層，已開發(fā)出多種組織工程皮膚，部分已商品化并取得了較好的臨床效果。但現(xiàn)有各類組織工程皮膚也面臨著一個(gè)共同的難題，即缺乏皮膚附件，如毛囊、皮脂腺和汗腺等。表皮干細(xì)胞是皮膚的成體干細(xì)胞，具有無限增殖潛能及多向分化潛能，理論上可以分化為皮膚的各種細(xì)胞成份和結(jié)構(gòu)，如毛囊、汗腺等。毛乳頭細(xì)胞為表皮干細(xì)胞壁龕提供了最好的條件，是誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞向毛囊定向分化必需的條件。組織工程皮膚面臨的另一個(gè)重要難題是免疫排斥。異體脫細(xì)胞真皮是目前臨床應(yīng)用最為廣泛的真皮替代物，雖然去除了真皮中的細(xì)胞成份，又通過戊二醛交聯(lián)降低了膠原的免疫原性，但由于脫細(xì)胞真皮再血管化時(shí)間長，容易發(fā)生膠原變性而暴露其抗原決定簇，增加免疫排斥反應(yīng)。人工真皮多接種異體成人的成纖維細(xì)胞，亦增加了其抗原性。而胎兒皮膚組織免疫原性相對較低，利用胎兒真皮修復(fù)燒傷創(chuàng)面未見明顯免疫排斥反應(yīng)，一些組織工程皮膚的真皮內(nèi)亦接種胎兒成纖維細(xì)胞以降低可能的免疫反應(yīng)。第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文皮膚是一種較理想的基因治療靶器官，但由于表皮的不斷更新，外源基因難以持久表達(dá)。表皮干細(xì)胞是終身存在的，且千細(xì)胞的遺傳信息可以傳給子代細(xì)胞，因而是基因治療理想的靶細(xì)胞。二.研究目的本課題的研究目的是利用毛乳頭細(xì)胞誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞分化為毛囊，利用胎兒皮膚細(xì)胞為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚以最大限度地降低免疫原性，同時(shí)嘗試將外源基因轉(zhuǎn)染至表皮干細(xì)胞，為表皮干細(xì)胞應(yīng)用于基因治療提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。三.研究內(nèi)容 1.體外分離培養(yǎng)人胎兒角質(zhì)形成細(xì)胞。DISpase酶分離表皮和真皮;胰酶消化法獲得表皮細(xì)胞懸液;凍存表皮細(xì)胞懸液以保證以后所有實(shí)驗(yàn)使用的角質(zhì)形成細(xì)胞和表皮干細(xì)胞均為同一個(gè) 體來源;用含有血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)原代角質(zhì)形成細(xì)胞并收集培養(yǎng)液用于下一步實(shí)驗(yàn);用無血清培養(yǎng)基行傳代培養(yǎng);凍存角質(zhì)形成細(xì)胞;同法培養(yǎng)成人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞作為對照。 2.體外分離培養(yǎng)人胎兒成纖維細(xì)胞。DISpase酶分離表皮和真皮;胰酶消化法和組織塊法培養(yǎng)成纖維細(xì)胞;收集成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液用于下一步實(shí)驗(yàn):凍存成纖維細(xì)胞;同法培養(yǎng)成人成纖維細(xì)胞作為對照。 3.人胎兒表皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定。用Dispase酶分離表皮得到表皮細(xì)胞懸液或使用凍存的同一個(gè)體的表皮細(xì)胞懸液;采用W型膠原快速粘附法分離富集表皮干細(xì)胞;成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液配制干細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng);流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，測定克隆形成率，角蛋白19和整合素pl免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行鑒定并與角質(zhì)形成細(xì)胞比較。 4.表皮干細(xì)胞的體外基因轉(zhuǎn)染。擴(kuò)增pcDNA3.1一VEGF165質(zhì) 粒;DNA限制性內(nèi)切酶酶切分析及DNA測序鑒定擴(kuò)增的質(zhì)粒DNA; lipofecTAMINE脂質(zhì)體介導(dǎo)VEGF165基因轉(zhuǎn)染;重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染;抗VEGF165單抗免疫組織化學(xué)染色及熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果。 5.人胎兒真皮毛乳頭細(xì)胞分離培養(yǎng)。顯微器械分離法及器第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文械分離+膠原酶消化二步法分離毛乳頭并比較兩種方法的效率; 有血清DMEM培養(yǎng)基，含生長因子的有血清DMEM培養(yǎng)基以及角質(zhì) 形成細(xì)胞條件培養(yǎng)基等3種培養(yǎng)液進(jìn)行毛乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)并比較細(xì)胞生長情況;a一平滑肌肌動(dòng)蛋白免疫組織化學(xué)染色鑒定毛乳頭細(xì)胞并與成纖維細(xì)胞區(qū)別;凍存毛乳頭細(xì)胞用于裸鼠移植;同法培養(yǎng)成人毛乳頭細(xì)胞作為對照。 6.毛囊再生試驗(yàn)。以表皮干細(xì)胞膜片為重建表皮，以接種毛乳頭細(xì)胞的膠原纖維凝膠為重建真皮構(gòu)建組織工程皮膚;組織工程皮膚的體外培養(yǎng);培養(yǎng)的組織工程皮膚移植修復(fù)裸鼠背部全層皮膚缺損創(chuàng)面;術(shù)區(qū)皮膚病理切片觀察再生皮膚結(jié)構(gòu)及毛囊再生情況;抗人角蛋白14鑒定新生皮膚的來源;以角質(zhì)形成細(xì)胞膜片為重建表皮的對照，以接種成纖維細(xì)胞的膠原纖維凝膠為重建真皮的對照。四.研究結(jié)果 1.人胎兒角質(zhì)形成細(xì)胞體外可傳代培養(yǎng)11一12代，而成人角質(zhì)形成細(xì)胞可傳代培養(yǎng)5代;凍存的表皮細(xì)胞懸液復(fù)蘇后培養(yǎng) 情況與新鮮標(biāo)本相同。 2.消化法及組織塊法培養(yǎng)的人胎兒成纖維細(xì)胞體外生長旺盛，與成人成纖維細(xì)胞無明顯區(qū)別;凍存及復(fù)蘇操作對細(xì)胞生長情況無明顯影響。 3.表皮干細(xì)胞在W型膠原上孵育10分鐘即可貼附，細(xì)胞生長緩慢，可形成大克隆;克隆形成率為17.11%，而角質(zhì)形成細(xì)胞為7.33%，有顯著差異，P0.001;細(xì)胞周期分析G;期、GZ期和S 期細(xì)胞分別占93.7%、2.1%和4.2%，而角質(zhì)形成細(xì)胞分別為 75.15%、8.3%和16.55%，有顯著差異，P0.001;角蛋白19和
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

原代培養(yǎng),角質(zhì)形成細(xì)胞,胎兒,細(xì)胞