據(jù)WHO資料統(tǒng)計，到2000年全球約有3.5億HBV攜帶者。其中，大約有5％～10％的成人和80％～90％的兒童成為慢性乙型肝炎(CHB)。慢性乙型肝炎的長期病程結(jié)局是肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌(HCC)。目前，治療慢性乙型肝炎最有效的藥物是干擾素(IFN)和核苷類似物(如拉米夫定等)。對于肝臟有一定炎癥活動的慢性乙型肝炎患者，規(guī)范應(yīng)用IFN-α后HBeAg的轉(zhuǎn)陰率或血清學(xué)轉(zhuǎn)換率約有20％～40％。由于中國患者中許多系圍生期或幼年時期感染，對HBV長期呈免疫耐受狀態(tài)，IFN-α的抗HBV療效大多不理想。拉米夫定為核苷類似物，具有強(qiáng)大的抑制HBV DNA復(fù)制的功效，但停藥后常常導(dǎo)致HBV復(fù)制的“反跳”，且長期治療易發(fā)生HBV聚合酶基因YMDD基序及其它位點的變異，導(dǎo)致拉米夫定耐藥變異病毒株的出現(xiàn)和優(yōu)勢生長。以上表明慢性乙型肝炎的治療仍然是困擾生物醫(yī)學(xué)界的難題，亟需探求新型的治療藥物和方法。近年來一些研究者提出了許多特異性免疫治療措施，其中選擇應(yīng)用IFN或各類免疫調(diào)節(jié)劑以打破慢性乙型肝炎病人T細(xì)胞免疫的無反應(yīng)性的策略尤為引人注目，特別是采用重組蛋白疫苗和基因疫苗及肽疫苗的特異性疫苗治療，已在動物模型中進(jìn)行了研究并進(jìn)入臨床試驗。 DNA疫苗能同時誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，因此在目前的研究中倍受重視。但其誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的效率相對較低，尤其是對于大的動物種系和 第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 人類，這削弱了它們的實際應(yīng)用。盡管花費了相當(dāng)大的努力來提高DNA 疫苗的運輸和提呈效率，但在接種DNA疫苗后誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)中仍只能 檢測到少量的抗原。目前應(yīng)用的提高和調(diào)節(jié)DNA疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)有 兩種補(bǔ)充策略，即:補(bǔ)充應(yīng)用編碼細(xì)胞因子的質(zhì)粒;通過融合與細(xì)胞表 面受體分子結(jié)合的抗原，將DNA疫苗編碼的抗原靶向?qū)氲郊?xì)胞表面。 本研究中我們選擇HBV preSZ+S基因片段作為 DNA疫苗的靶抗原， 應(yīng)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建了peDNA3.1525、peDNA3.1525/IFNa、 pcDNA3.IIL一2/Fe、peDNA3SZS/Fe、peDNA3IFN一a五種真核表達(dá)質(zhì)粒，并 在Ver。一E6或SPZ/0真核細(xì)胞中進(jìn)行了瞬時表達(dá):重組質(zhì)粒經(jīng)大量制備 純化后免疫BALB/C小鼠，通過檢測各組小鼠免疫后的抗一HBs滴度、CTL 的殺傷活性、培養(yǎng)脾細(xì)胞的增殖分析、培養(yǎng)脾細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌水平 以及脾細(xì)胞中CD25的表達(dá)量，比較分析了含工L一2/Fc的質(zhì)粒作為基因型 佐劑對HBV preSZS DNA疫苗誘發(fā)免疫反應(yīng)的影響;并且分析比較了 peDNA3·1525/IFNQ和peDNA3SZS/Fe分別免疫后誘發(fā)的體液和細(xì)胞免疫 反應(yīng)。 主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下: 1.應(yīng)用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建五種真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1525、 peDNA3.1525/IFN一a、peDNA3.IIL一2/Fe、peDNA3SZS/Fe、peDNA3IFN- a，經(jīng)酶切和序列測定分析，確定目的片段的克隆和連接正確。 2.通過脂質(zhì)體介導(dǎo)，分別將它們轉(zhuǎn)染入ver。一E6或SPZ/0細(xì)胞中，經(jīng) EL工SA和間接免疫熒光法證實，可以在真核細(xì)胞中正確表達(dá)目的蛋白。 3.采用布比卡因預(yù)處理，100林g/只/次的方法肌肉注射后肢股四頭肌分 組免疫BALB/c小鼠，分別檢測誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。 4.pcDNA3.1工L一2/Fc免疫組在初次免疫后2周末即出現(xiàn)100%的抗一HBS 抗體陽轉(zhuǎn)率，CTL殺傷活性、淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)、Thl型細(xì)胞因子 的分泌水平及脾細(xì)胞CD25的表達(dá)量都比對照組明顯增強(qiáng)。 5.為了確定抗原與佐劑的最佳應(yīng)用方案，我們比較HBV DNA疫苗免疫后 第3天注射佐劑pcDNA3.l工L一2/Fc或兩者同時注射誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免 4 第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 疫效果，證明前者優(yōu)于后者，后者誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)和HBV DNA疫苗單 獨應(yīng)用時效果相當(dāng)。 6.我們同時進(jìn)行了HBV preSZS與工FN一a融合表達(dá)的重組質(zhì)粒 pCDNA3.1525/工FN。的實驗。通過檢測體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)顯示其誘 導(dǎo)的免疫反應(yīng)比單獨應(yīng)用工FN一a質(zhì)粒作為佐劑及對照組明顯增強(qiáng)。 7.pCDNA3SZS/Fc免疫組誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)與單獨應(yīng)用HBV DNA疫苗時的 效果相當(dāng)。 8.我們同時分析了抗原與細(xì)胞因子融合的形式pcDNA3.1525/工FN一Q質(zhì) 粒和pCDNA3.1工L一2/Fc作為免疫佐劑組所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的結(jié)果，通 過SPSS統(tǒng)計軟件分析，其差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

Figl乙肝病毒各型顆粒模式圖

HBV基因組結(jié)構(gòu)

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本文編號：2886403