發(fā)布時(shí)間：2020-11-11 14:06

　　 A類(lèi)清道夫受體(Scavenger receptor，SR-A)是一種主要位于巨噬細(xì)胞膜表面的同源三聚體糖蛋白，能夠介導(dǎo)多種配體進(jìn)行內(nèi)移。有關(guān)SR-A內(nèi)移的調(diào)控機(jī)制目前尚所知甚少，一般認(rèn)為其胞漿域部分不含引導(dǎo)內(nèi)移的信號(hào)序列，只有幾個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，但后者似乎不能完全介導(dǎo)受體的內(nèi)移，為深入探討A類(lèi)清道夫受體胞漿域在介導(dǎo)受體內(nèi)移中的作用，本研究以含有SR-A cDNA質(zhì)粒為模板，采用PCR的方法擴(kuò)增不含胞漿域序列的清道夫受體(以下簡(jiǎn)稱截短型受體)，同時(shí)擴(kuò)增全長(zhǎng)清道夫受體作為對(duì)照，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化酶切后，進(jìn)一步亞克隆到PcDNA3.1／HisB中，測(cè)序結(jié)果表明清道夫受體基因已經(jīng)重組到載體中，開(kāi)放性閱讀框架正確，編碼的氨基酸序列無(wú)誤。將重組產(chǎn)物經(jīng)脂質(zhì)體Lipofectamine(LF2000)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化入CHO細(xì)胞中，在含G418選擇性培養(yǎng)液中培養(yǎng)篩選14天后，分離陽(yáng)性克隆，繼續(xù)培養(yǎng)。采用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(FACS)鑒定轉(zhuǎn)化篩選后細(xì)胞能否表達(dá)具有功能的清道夫受體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞可以穩(wěn)定表達(dá)SR-A的蛋白，但受體胞漿域去除后攝取配體的能力明顯弱于全長(zhǎng)組(1：1.337)。為進(jìn)一步比較兩組細(xì)胞受體內(nèi)移的改變，用熒光DiI標(biāo)記乙�；兔芏戎鞍�(DiI-acLDL)37℃孵育轉(zhuǎn)化細(xì)胞5小時(shí)后，激光共聚焦顯微鏡下觀察到：全長(zhǎng)組熒光散在分布于細(xì)胞膜和細(xì)胞器，而截短組熒光只局限于細(xì)胞膜。用熒光分光光度計(jì)定量分析受體介導(dǎo)配體內(nèi)移率的改變，結(jié) 南京醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 果發(fā)現(xiàn)在與配體孵育10min、20min和40min后，全長(zhǎng)組SR一A對(duì) DII一acLDL的攝取率分別為26%、43 .3%和78.1%，而去除胞漿域后 DII一acLDL的攝取率則分別降至1 4.9%、17.05和14.7%，以上說(shuō)明受 體胞裝域去除后受體的內(nèi)移功能明顯受到抑制，從而證明SR一A胞漿 域起著介導(dǎo)受體內(nèi)移的作用。此外用蛋白激酶抑制劑staurosporine (STA)和H:處理細(xì)胞，利用熒光分光光度計(jì)比較細(xì)胞內(nèi)磷酸化水平 的變化對(duì)受體結(jié)合和攝取配體的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn):STA和H7可以增 加全長(zhǎng)組受體與配體的結(jié)合及攝取，而截短型受體不受STA和H7的 調(diào)控，說(shuō)明磷酸化藥物可能是通過(guò)SR-A胞漿域發(fā)揮作用。在此基礎(chǔ) 上進(jìn)一步比較胞漿域去除后對(duì)受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚和泡沫化的 影響，用高濃度的Ac一LDL處理細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)去除胞漿區(qū)的SR-A 只分布于細(xì)胞膜表面，不能介導(dǎo)配體一受體復(fù)合物進(jìn)入胞裝內(nèi)，受體 介導(dǎo)的配體內(nèi)移率明顯減少，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量下降，泡沫化細(xì)胞難以 形成。不僅如此，如將截短的SR一A轉(zhuǎn)入能正常表達(dá)SR-A的THP一1 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的脂質(zhì)含量明顯減少。該結(jié)果首次證明去除SR-A 的胞漿區(qū)后，可阻止泡沫細(xì)胞的形成。提示SR一A胞漿區(qū)可能是巨噬 細(xì)胞泡沫化的干預(yù)靶標(biāo)。
【學(xué)位單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類(lèi)】：R363
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
前言
材料與方法
結(jié)果
討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
綜述一
綜述二
在讀期間發(fā)表的論文目錄
在讀期間主持和參與完成的科研項(xiàng)目
重組于PCDNA3.1質(zhì)粒的SR-A的測(cè)序圖

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相關(guān)期刊論文 前2條

1 金艷,陳琪,王南,陳秀英,魏恩會(huì),周春蕾,范樂(lè)明;蛋白激酶C抑制劑對(duì)U937細(xì)胞清道夫受體功能的影響[J];生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào);1999年04期

2 金艷,陳琪,魏恩會(huì),蔣莉,范樂(lè)明,王南,陳秀英;酪氨酸蛋白激酶抑制劑genistein對(duì)PMA處理后A類(lèi)清道夫受體表達(dá)的抑制[J];生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào);2001年01期

本文編號(hào)：2879284