已有的研究資料向人們清楚地顯示，亞溶破MAC可活化多種細(xì)胞生物 學(xué)效應(yīng)，是體內(nèi)補(bǔ)體過度活化病理效應(yīng)的重要介導(dǎo)者之一。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn) MAC沉積后可活化細(xì)胞內(nèi)多種胞內(nèi)信號分子，但MAC插入膜上后通過何種 機(jī)制介導(dǎo)胞內(nèi)信號途徑的活化目前仍不清楚。已知MAC插入質(zhì)膜不需任何 受體，除了與已知的兩種終末補(bǔ)體調(diào)控蛋白C8bp和CD59結(jié)合外，目前尚 未證實(shí)沉積于細(xì)胞表面MAC與其它的分子有直接的相互作用。那么，MAC 的跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制究竟是什么？作為一個(gè)高度親脂性蛋白，插入膜上的 MAC引起細(xì)胞信號傳導(dǎo)入腦究竟有什么特殊之處？ 近年研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物細(xì)胞質(zhì)膜表面存在主要由糖鞘脂（GSL）、鞘磷 脂（SM）及膽固醇聚集形成的膜微區(qū)結(jié)構(gòu)，GPI錨固蛋白及其他一些膜分子， 特別是一些重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子如Src家族PTK、異三聚體G蛋白等，相 對特異性聚集于其中。Caveolae是多種細(xì)胞表面的膜微區(qū)形式，因具有特 征性的燒瓶樣質(zhì)膜內(nèi)陷和特征性的結(jié)構(gòu)蛋白caveolin而可與其它的膜微 區(qū)相區(qū)別。大量的研究顯示，質(zhì)膜上的這些膜局限性結(jié)構(gòu)域中聚集著許多 重要跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在細(xì)胞跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。此外，越 來越多的細(xì)胞生物學(xué)行為包括內(nèi)吞、物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、膜蛋白的定向分選 等均被發(fā)現(xiàn)與膜微區(qū)的功能相聯(lián)系。對生理狀態(tài)下膜微區(qū)結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn) 識是一個(gè)目前研究非常活躍的領(lǐng)域。 、在思索MAC的跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的可能機(jī)制中，我們發(fā)現(xiàn)了以下有意義的 線索：第一，已經(jīng)證實(shí)的多種參與MAC活化細(xì)胞的信號途徑幾乎無一例外 地被證實(shí)與質(zhì)膜微區(qū)相聯(lián)系，提示MAC可能與caveolae有功能上的聯(lián)系。 第二，MAC在膜上的天然受體C8bP和CD59均為GPI－錨固型蛋白，近年的 研究證實(shí)W－錨固蛋白成簇分布于膜微區(qū)之中。而這些調(diào)控蛋白在細(xì)胞表 面高表達(dá)，可迅速地與沉積在膜上的MAC相結(jié)合。那么，特異性地定位于 特殊的膜微區(qū)之中的 CD59兒8bP對 MAC的分布有何影響？是否可介導(dǎo) MAC 定位于膜微區(qū)之中？第三，MAC作為高度親脂性的復(fù)合物，沉積于膜上后 可與脂質(zhì)分子結(jié)合，形成膠束區(qū)并引起膜脂質(zhì)重排。那么，MAC是否可與 質(zhì)膜上大量散在分布的膜微區(qū)相互作用？ 基于以上的分析，我們大膽設(shè)想，MAC沉積至細(xì)胞膜上后，可通過與 脂質(zhì)的相互作用而與膜微區(qū)產(chǎn)生物理上和功能上的聯(lián)系。為探明沉積于細(xì) 胞表面的MAC與膜微區(qū)的關(guān)系，我們以人血管內(nèi)皮細(xì)胞為模型，建立MAC 亞溶破體系并檢測其刺激效應(yīng)：純化內(nèi)皮細(xì)胞表面的caveolae結(jié)構(gòu)，檢測 MAC與caved 富集的膜區(qū)段之間的關(guān)系以及特異性破壞caveolae對MAC 介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活化效應(yīng)的影響。我們期望通過這一研究，更多地了解MAC 與膜上脂質(zhì)分子的相互作用情況，并從一個(gè)新的角度認(rèn)識eC可能的跨膜 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。本文的主要研究內(nèi)容及結(jié)果包括： 1．以純化的補(bǔ)體終末成分體外組裝MAC，并以之建立內(nèi)皮細(xì)胞亞溶 破模型。其中CS的活化通過蛋氨酸氧化的方法在不裂解CS的條件下獲得。 這種體外組裝策略保證了體系中的刺激因素是真正功能純的MAC，為進(jìn)一 步深入研究MAC的病理效應(yīng)及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ)。 2．在MAC的內(nèi)皮細(xì)胞亞溶破模型中，多角度地檢測了亞溶破劑量的 MAC對內(nèi)皮細(xì)胞的兩種不同途徑的分泌－－－－P小體分泌反應(yīng)和需基因轉(zhuǎn) 錄的新蛋白合成分泌途徑的活化效應(yīng)，并以激光共聚焦顯微鏡動態(tài)觀察 MAC沉積引起胞漿＊a‘”j i的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，eC可刺激內(nèi)皮細(xì)胞 W干 ’J’ 體分泌反應(yīng)，引起 VWF因子快速釋放出胞：亞溶破劑量 MAC可誘導(dǎo) IL士 趨化因子的蛋白合成及分泌；激光共聚焦顯微鏡下觀測到MAC沉積后引起 ·Vlll· 的胞漿＊a’”j i增高和鈣振蕩，并發(fā)現(xiàn)不同的細(xì)胞在 MAC沉積后＊a‘”j i變 化模式存在異質(zhì)性。 3．低溫條件下以非離子型去污劑Trtion《 100純化內(nèi)皮細(xì)胞表面的 caveolae結(jié)構(gòu)，檢測沉積于細(xì)胞表面的MAC在蔗糖密度梯度離心場中的位 置。結(jié)果顯示，沉積于膜上的MAC特征性地濃聚于低密度去污劑不溶性膜 區(qū)段中，該區(qū)段同時(shí)有caveolin的富集，提示MAC與caveolae存在直接 的物理聯(lián)系。以甘露糖胺抑制內(nèi)皮細(xì)胞GPI－錨固蛋白的表達(dá)，補(bǔ)體終末成 分的分布無明顯改變，說明MAC的caveolae分布特性不依賴GPI－錨固蛋 白CD59。這是首次報(bào)道沉積于質(zhì)膜表面的MAC與caveolae存在直接的物 理聯(lián)系。 4．在證實(shí)MAC與cave01ae徽區(qū)結(jié)構(gòu)有直接的物理聯(lián)系的基礎(chǔ)上，以 膽固醇結(jié)合劑Fn 和Nystatin特異性地破壞細(xì)胞表面冊veolae結(jié)構(gòu) 和功能，觀測其對MAC介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞刺激效應(yīng)的可能影響。結(jié)果顯示， 特異性地破壞caveolae的結(jié)構(gòu)與功能使MAC刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌幾E的效 應(yīng)明顯減低，但對VWF的分泌沒有影響，提示MAC對胞內(nèi)信號活化依賴 caveolae微區(qū)結(jié)構(gòu)。此外，特異性抑偉聚集于caveolae 中的Src家族PTK 活性后，MAC刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌幾干的效應(yīng)也顯著地受到抑制。這一結(jié)果 提示，eC沉積于細(xì)胞表面后，可活化聚集于caveolae中的非
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2001
【中圖分類】：R392.11
【文章目錄】：
英文縮寫詞表
英文摘要
中文摘要
論文正文 補(bǔ)體攻膜復(fù)合物內(nèi)皮細(xì)胞刺激效應(yīng)及其活化機(jī)制的研究
    前言
    第一章 內(nèi)皮細(xì)胞MAC亞溶破細(xì)胞模型的建立及其多種細(xì)胞刺激效應(yīng)的檢測
        第一節(jié) 氯胺-T氧化法活化C5、組裝補(bǔ)體膜攻擊復(fù)合物及其鑒定
        第二節(jié) 補(bǔ)體攻膜復(fù)合物內(nèi)皮細(xì)胞亞溶破模型的建立及其細(xì)胞刺激效應(yīng)
        第三節(jié) MAC刺激體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣離子濃度變化
        第四節(jié) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞對沉積的MAC的清除作用研究
    第二章 補(bǔ)體攻膜復(fù)合物與細(xì)胞表面膜微區(qū)的相互作用研究
        第一節(jié) 內(nèi)皮細(xì)胞Caveolae結(jié)構(gòu)的純化制備
        第二節(jié) 沉積于質(zhì)膜表面的MAC與Caveolae的關(guān)系
        第三節(jié) Caveolae參與介導(dǎo)MAC細(xì)胞刺激效應(yīng)
        第四節(jié) 內(nèi)皮細(xì)胞通過Caveolae介導(dǎo)細(xì)胞表面MAC的清除
總結(jié)
致謝
照片
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述 Caveolin家族分子研究進(jìn)展
    參考文獻(xiàn)
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的文章

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 安靜,黎鰲,楊宗城;胎兒臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1990年03期

本文編號：2876169