我們之前的研究發(fā)現(xiàn),來(lái)自 GTKO/hCD46(α1,3-galactosyltrans-ferasegene knockout and human complement regulatory protein CD46,α1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因敲除并表達(dá)人類補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46)基因修飾豬脂肪組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)具有較弱的異種免疫原性,體外共培養(yǎng)環(huán)境下,不會(huì)引起人的淋巴細(xì)胞對(duì)其產(chǎn)生明顯的免疫應(yīng)答反應(yīng),然而,關(guān)于GTKO/hCD46豬脂肪來(lái)源的MSC對(duì)人T細(xì)胞具體的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制尚不明確。基于文獻(xiàn)報(bào)道及之前的研究我們提出以下幾點(diǎn)假想,即GTKO/hCD46 pMSC可能通過(guò)1)誘導(dǎo)人T細(xì)胞發(fā)生凋亡;2)抑制T細(xì)胞的活化;3)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)的產(chǎn)生等方式來(lái)抑制人T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。研究目的和方法:為了進(jìn)一步評(píng)估體外環(huán)境下,GTKO/hCD46 pMSC分別對(duì)人CD4+T和CD8+T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用并探討可能存在的作用機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)將從以下幾方面開(kāi)展:第一部分:實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞包括豬脂肪組織來(lái)源MSC(porcine adipose-derived MSC,pMSC)和腹主動(dòng)脈來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞(porcine aortic endothelial cells,pAEC)的提取和培養(yǎng),并通過(guò)誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)和對(duì)干細(xì)胞分子標(biāo)記物的檢測(cè)對(duì)pMSC進(jìn)行鑒定。第二部分:將提純后的人CD4+T和CD8 + T細(xì)胞分別與pMSC pAEC或兩者同時(shí)進(jìn)行體外混合細(xì)胞培養(yǎng)(mixed lymphocyte reaction,MLR),通過(guò)檢測(cè)T細(xì)胞結(jié)合的DNA合成前體(3H-胸腺嘧啶核苷)的比率來(lái)評(píng)估T細(xì)胞的增殖程度,最終結(jié)果將以每分鐘脈沖數(shù)(counts per minute,CPM)來(lái)表示;此外,在傳統(tǒng)基礎(chǔ)上建立兩步法MLR,評(píng)估共培養(yǎng)后濾除pMSC的情況下T細(xì)胞的免疫狀態(tài);第三部分:通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)混合培養(yǎng)之后pMSC對(duì)人T細(xì)胞的活化、凋亡、顆粒酶的表達(dá)以及對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)的誘導(dǎo)等方面的影響,從而對(duì)探討GTKO/hCD46 pMSC對(duì)人T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。第四部分:通過(guò)免疫印記法進(jìn)一步對(duì)可能影響T細(xì)胞增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子 5(signal transducer and activator of transcription 5,STAT5)的活化情況進(jìn)行檢測(cè),并分析STAT5在MSC發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用中的價(jià)值。研究結(jié)果:第一部分:由GTKO/hCD46豬脂肪組織可以有效地獲取大量的成纖維細(xì)胞樣的細(xì)胞集落貼壁生長(zhǎng)。流式細(xì)胞術(shù)鑒定表達(dá)常見(jiàn)的干細(xì)胞分子標(biāo)記物,經(jīng)誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)顯示具備向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化的潛能。第二部分:在與人T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)之后,CD4+T和CD8+T的增殖反應(yīng)較弱,與T細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組結(jié)果無(wú)顯著差異(P0.05),以pAEC與T細(xì)胞培養(yǎng)作為陽(yáng)性對(duì)照,pMSC和pAEC同時(shí)與T細(xì)胞共培養(yǎng),可顯著抑制T細(xì)胞的增殖反應(yīng)(P0.05),并呈現(xiàn)劑量依賴的趨勢(shì)。兩步法MLR提示,共培養(yǎng)結(jié)束后去除GTKO/hCD46pMSC,CD4+T細(xì)胞仍可以維持對(duì)異種抗原(GTKO pAEC)的低反應(yīng)狀態(tài),而CD8+T細(xì)胞則可以迅速恢復(fù)免疫增殖狀態(tài)。第三部分:1)以GTKOpAEC共培養(yǎng)組作為對(duì)照,GTKO/hCD46pMSC能夠顯著地降低CD4+T和CD8+T細(xì)胞上顆粒酶B的表達(dá)水平(P0.05),而pMSC共培養(yǎng)組T細(xì)胞中CD4 +CD25 +Foxp3hi T細(xì)胞的比例無(wú)顯著性升高,(P0.05)。T細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組和pMSC共培養(yǎng)組發(fā)生凋亡的T細(xì)胞比例分別為0.53±0.25%vs0.57±0.35%,兩者之間沒(méi)有顯著性差異(P0.05)。GTKO/hCD46 pMSC對(duì)于T細(xì)胞活化因子CD25和LAG-3的表達(dá)沒(méi)有顯著性的影響,卻能夠明顯的上調(diào)T細(xì)胞CD69的表達(dá)(P0.01)。第四部分:人T細(xì)胞在與GTKO/hCD46pMSC與共培養(yǎng)之后,細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子 5(signal transducer and activator of transcription 5,STAT5)的磷酸化比率顯著高于T細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組(P0.05)研究結(jié)果:1)GTKO/CD46 pMSC能夠由GTKO/hCD46豬脂肪組織有效地獲取,細(xì)胞能夠貼壁生長(zhǎng),并呈成纖維細(xì)胞樣的細(xì)胞集落;2)GTKO/CD46 pMSC在體外共培養(yǎng)條件下,能夠有效地抑制CD4 +和CD8 + T細(xì)胞的增殖,抑制作用表現(xiàn)為劑量依賴性,并且MSC對(duì)于CD4 +T的免疫調(diào)節(jié)作用相對(duì)于CD8+T細(xì)胞更加持久。3)GTKO/CD46pMSC對(duì)于T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)不是通過(guò)誘導(dǎo)Treg也不是誘導(dǎo)T細(xì)胞發(fā)生凋亡的途徑來(lái)實(shí)現(xiàn);4)GTKO/CD46 pMSC可能通過(guò)上調(diào)細(xì)胞CD69表達(dá)進(jìn)而影響下游STAT5信號(hào)傳導(dǎo)途徑,并最終實(shí)現(xiàn)對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

并均勻分布于培養(yǎng)瓶壁之上，２代擴(kuò)増之后，ＭＳＣ細(xì)胞形態(tài)與骨髓來(lái)??源的ＭＳＣ細(xì)胞形態(tài)相同，呈現(xiàn)均一的梭形。相比骨髓ＭＳＣ，脂肪組織來(lái)源的??ＭＳＣ細(xì)胞純度較高，生長(zhǎng)較迅速（見(jiàn)圖１），用于比較的骨髓ＭＳＣ來(lái)自于本??實(shí)驗(yàn)保存的ＧＴＫＯ／ｈＣＤ４６豬骨髓提取的ＭＳＣ細(xì)胞。??ＧＴＫＯ化ＣＤ４６豬脂肪ＭＳＣ?ＧＴＫＯ化ＣＤ４６豬骨髓ＭＳＣ??化２ｌＯｘ）??■Ｈ?ｐｉｐ??ｍｍｉ：?＾??（Ｐ２?２〇ｘ）??■Ｈ??ＷＢＭ??ＨｈｈｈＨ?ｅｓｈｅｈ??（Ｐ２?４０?Ｘ）??圖１?ＧＴＫＯ／ｈＣＤ４６豬脂肋組織及骨髓來(lái)源的ＭＳＣ的鏡下形態(tài)比較??１０??

ＣＤ４４，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，不表達(dá)?ＣＤ３１?和?ＣＤ４５?（見(jiàn)圖?２ａ）。此外，與??野生型ｐＭＳＣ相比（表達(dá)Ｇａｌ抗原，經(jīng)基因修飾之后的ｐＭＳＣ不表達(dá)Ｇａｌ抗原??（見(jiàn)圖２ｃ），同時(shí)ＧＴＫＯ／ｈＣＤ４６?ｐＭＳＣ有９９．７〇／〇的細(xì)胞表達(dá)被修飾蛋白ｈＣＤ４６??（見(jiàn)圖化）。??（圖?２ａ）??ＣＤ巧?ＣＤ４４?ＣＤ７３??進(jìn)皇??ＣＤ１０５?ＣＤ１６６?ＣＰ３１?甜始??圖２?ＧＴＫＯ化ＣＤ４６豬脂肪組織來(lái)源的ＭＳＣ的表型分析??１１??

ＣＤ４４，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，不表達(dá)?ＣＤ３１?和?ＣＤ４５?（見(jiàn)圖?２ａ）。此外，與??野生型ｐＭＳＣ相比（表達(dá)Ｇａｌ抗原，經(jīng)基因修飾之后的ｐＭＳＣ不表達(dá)Ｇａｌ抗原??（見(jiàn)圖２ｃ），同時(shí)ＧＴＫＯ／ｈＣＤ４６?ｐＭＳＣ有９９．７〇／〇的細(xì)胞表達(dá)被修飾蛋白ｈＣＤ４６??（見(jiàn)圖化）。??（圖?２ａ）??ＣＤ巧?ＣＤ４４?ＣＤ７３??進(jìn)皇??ＣＤ１０５?ＣＤ１６６?ＣＰ３１?甜始??圖２?ＧＴＫＯ化ＣＤ４６豬脂肪組織來(lái)源的ＭＳＣ的表型分析??１１??
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本文編號(hào)：2874004