我們之前的研究發(fā)現(xiàn),來自 GTKO/hCD46(α1,3-galactosyltrans-ferasegene knockout and human complement regulatory protein CD46,α1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因敲除并表達人類補體調(diào)節(jié)蛋白CD46)基因修飾豬脂肪組織來源的間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)具有較弱的異種免疫原性,體外共培養(yǎng)環(huán)境下,不會引起人的淋巴細胞對其產(chǎn)生明顯的免疫應答反應,然而,關(guān)于GTKO/hCD46豬脂肪來源的MSC對人T細胞具體的免疫調(diào)節(jié)作用機制尚不明確�；谖墨I報道及之前的研究我們提出以下幾點假想,即GTKO/hCD46 pMSC可能通過1)誘導人T細胞發(fā)生凋亡;2)抑制T細胞的活化;3)誘導調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell,Treg)的產(chǎn)生等方式來抑制人T細胞的免疫應答。研究目的和方法:為了進一步評估體外環(huán)境下,GTKO/hCD46 pMSC分別對人CD4+T和CD8+T細胞的免疫調(diào)節(jié)作用并探討可能存在的作用機制,本實驗將從以下幾方面開展:第一部分:實驗所用細胞包括豬脂肪組織來源MSC(porcine adipose-derived MSC,pMSC)和腹主動脈來源的內(nèi)皮細胞(porcine aortic endothelial cells,pAEC)的提取和培養(yǎng),并通過誘導分化實驗和對干細胞分子標記物的檢測對pMSC進行鑒定。第二部分:將提純后的人CD4+T和CD8 + T細胞分別與pMSC pAEC或兩者同時進行體外混合細胞培養(yǎng)(mixed lymphocyte reaction,MLR),通過檢測T細胞結(jié)合的DNA合成前體(3H-胸腺嘧啶核苷)的比率來評估T細胞的增殖程度,最終結(jié)果將以每分鐘脈沖數(shù)(counts per minute,CPM)來表示;此外,在傳統(tǒng)基礎(chǔ)上建立兩步法MLR,評估共培養(yǎng)后濾除pMSC的情況下T細胞的免疫狀態(tài);第三部分:通過流式細胞術(shù)檢測混合培養(yǎng)之后pMSC對人T細胞的活化、凋亡、顆粒酶的表達以及對調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell,Treg)的誘導等方面的影響,從而對探討GTKO/hCD46 pMSC對人T細胞的免疫調(diào)節(jié)機制。第四部分:通過免疫印記法進一步對可能影響T細胞增殖的信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子 5(signal transducer and activator of transcription 5,STAT5)的活化情況進行檢測,并分析STAT5在MSC發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用中的價值。研究結(jié)果:第一部分:由GTKO/hCD46豬脂肪組織可以有效地獲取大量的成纖維細胞樣的細胞集落貼壁生長。流式細胞術(shù)鑒定表達常見的干細胞分子標記物,經(jīng)誘導分化實驗顯示具備向脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞分化的潛能。第二部分:在與人T細胞進行共培養(yǎng)之后,CD4+T和CD8+T的增殖反應較弱,與T細胞單獨培養(yǎng)組結(jié)果無顯著差異(P0.05),以pAEC與T細胞培養(yǎng)作為陽性對照,pMSC和pAEC同時與T細胞共培養(yǎng),可顯著抑制T細胞的增殖反應(P0.05),并呈現(xiàn)劑量依賴的趨勢。兩步法MLR提示,共培養(yǎng)結(jié)束后去除GTKO/hCD46pMSC,CD4+T細胞仍可以維持對異種抗原(GTKO pAEC)的低反應狀態(tài),而CD8+T細胞則可以迅速恢復免疫增殖狀態(tài)。第三部分:1)以GTKOpAEC共培養(yǎng)組作為對照,GTKO/hCD46pMSC能夠顯著地降低CD4+T和CD8+T細胞上顆粒酶B的表達水平(P0.05),而pMSC共培養(yǎng)組T細胞中CD4 +CD25 +Foxp3hi T細胞的比例無顯著性升高,(P0.05)。T細胞單獨培養(yǎng)組和pMSC共培養(yǎng)組發(fā)生凋亡的T細胞比例分別為0.53±0.25%vs0.57±0.35%,兩者之間沒有顯著性差異(P0.05)。GTKO/hCD46 pMSC對于T細胞活化因子CD25和LAG-3的表達沒有顯著性的影響,卻能夠明顯的上調(diào)T細胞CD69的表達(P0.01)。第四部分:人T細胞在與GTKO/hCD46pMSC與共培養(yǎng)之后,細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子 5(signal transducer and activator of transcription 5,STAT5)的磷酸化比率顯著高于T細胞單獨培養(yǎng)組(P0.05)研究結(jié)果:1)GTKO/CD46 pMSC能夠由GTKO/hCD46豬脂肪組織有效地獲取,細胞能夠貼壁生長,并呈成纖維細胞樣的細胞集落;2)GTKO/CD46 pMSC在體外共培養(yǎng)條件下,能夠有效地抑制CD4 +和CD8 + T細胞的增殖,抑制作用表現(xiàn)為劑量依賴性,并且MSC對于CD4 +T的免疫調(diào)節(jié)作用相對于CD8+T細胞更加持久。3)GTKO/CD46pMSC對于T細胞的免疫調(diào)節(jié)不是通過誘導Treg也不是誘導T細胞發(fā)生凋亡的途徑來實現(xiàn);4)GTKO/CD46 pMSC可能通過上調(diào)細胞CD69表達進而影響下游STAT5信號傳導途徑,并最終實現(xiàn)對T細胞增殖的抑制作用。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2013
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

并均勻分布于培養(yǎng)瓶壁之上，２代擴増之后，ＭＳＣ細胞形態(tài)與骨髓來??源的ＭＳＣ細胞形態(tài)相同，呈現(xiàn)均一的梭形。相比骨髓ＭＳＣ，脂肪組織來源的??ＭＳＣ細胞純度較高，生長較迅速（見圖１），用于比較的骨髓ＭＳＣ來自于本??實驗保存的ＧＴＫＯ／ｈＣＤ４６豬骨髓提取的ＭＳＣ細胞。??ＧＴＫＯ化ＣＤ４６豬脂肪ＭＳＣ?ＧＴＫＯ化ＣＤ４６豬骨髓ＭＳＣ??化２ｌＯｘ）??■Ｈ?ｐｉｐ??ｍｍｉ：?＾??（Ｐ２?２〇ｘ）??■Ｈ??ＷＢＭ??ＨｈｈｈＨ?ｅｓｈｅｈ??（Ｐ２?４０?Ｘ）??圖１?ＧＴＫＯ／ｈＣＤ４６豬脂肋組織及骨髓來源的ＭＳＣ的鏡下形態(tài)比較??１０??

ＣＤ４４，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，不表達?ＣＤ３１?和?ＣＤ４５?（見圖?２ａ）。此外，與??野生型ｐＭＳＣ相比（表達Ｇａｌ抗原，經(jīng)基因修飾之后的ｐＭＳＣ不表達Ｇａｌ抗原??（見圖２ｃ），同時ＧＴＫＯ／ｈＣＤ４６?ｐＭＳＣ有９９．７〇／〇的細胞表達被修飾蛋白ｈＣＤ４６??（見圖化）。??（圖?２ａ）??ＣＤ巧?ＣＤ４４?ＣＤ７３??進皇??ＣＤ１０５?ＣＤ１６６?ＣＰ３１?甜始??圖２?ＧＴＫＯ化ＣＤ４６豬脂肪組織來源的ＭＳＣ的表型分析??１１??

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本文編號：2874004