CTLA4Ig是人CTLA4胞外區(qū)與人免疫球蛋白鉸鏈區(qū)、CH2、CH3區(qū)組成的融合蛋白,可以與B7結(jié)合,通過阻斷B7與CD28的結(jié)合,從而阻斷B7介導(dǎo)的T細胞活化必需的共刺激信號,可作為免疫抑制劑用于器官移植。在本研究中,我們將CTLA4Ig融合分子克隆到真核表達載體pCI-dhfr,并用脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染到COS7和CHO-dhfr細胞中,轉(zhuǎn)染的CHO-dhfr-細胞用氨甲喋呤(MTX)進行篩選。重組蛋白的表達用RT-PCR,ELISA,細胞免疫熒光染色和Western-blot進行鑒定。最后采用protein A純化重組蛋白質(zhì)。 CTLA4是T細胞表面T細胞活化的負調(diào)控因子,和CD28同樣為B7分子的配體。雖然T細胞表面的CTLA-4表達非常少,其表達豐度僅為CD28的2%-3%,但CTLA-4與B7分子的結(jié)合力要比CD28與B7的結(jié)合力高20-50倍。。因此,CTLA-4具有優(yōu)先結(jié)合B7分子的特性,其作用在于傳遞陰性第二信號,調(diào)節(jié)T細胞活化。CTLA4Ig是人CTLA4胞外區(qū)與人免疫球蛋白鉸鏈區(qū)、CH2、CH3區(qū)組成的融合蛋白,與細胞表面的B7分子結(jié)合后,可以起到封閉作用。利用多種方法研究表明,CTLA4Ig是一種新型的人源性粘附分子類免疫抑制劑,治療以T細胞為主介導(dǎo)的移植排斥反應(yīng)是其最具潛力的應(yīng)用領(lǐng)域。另外,抗CTLA4抗體還能夠有效地用于抗腫瘤治療。本研究將CTLA4Ig融合分子克隆到含二氫葉酸還原酶(dhfr)基因的真核表達載體pCI-dhfr中,并轉(zhuǎn)染到CHO-dhfr細胞中獲得了穩(wěn)定表達,為進一步篩選高表達的工程細胞株奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2002
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

用HRP一抗人Fc抗體3o7C作用45分鐘后，ECL顯也可用鼠抗人CTLA4先進行反應(yīng)，再加入HRP一羊抗鼠gIGECL顯色體系進行顯色。果AL4gI融合基因的克隆和鑒定真核表達載體PIGI一CTLA4Ig用EocVR和Notl雙酶切后，得LA4Ig的基因片段，包括Fe段1500bp基因和CTLA450obp的一hdrf空載體連接后，用菌落PCR法，從挑出的6個克隆中，4號三個陽性克隆。再將陽性克隆小量提取質(zhì)粒，以Eoc咫十結(jié)果都有CTLA4gI基因片段的插入。將其中的第3號克隆4Ig。用Qgien公司的大提質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒，準(zhǔn)備用于轉(zhuǎn)

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RT一PCR，
【參考文獻】

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1 牟芝蓉,吳玉章;CTL的免疫識別[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2000年10期

2 李舒梅,童競亞;細菌防治腫瘤的研究進展[J];贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2000年03期

3 龐志宇,暢繼武;糖基化磷脂酰肌醇錨定蛋白轉(zhuǎn)化法——一門全新的細胞表面工程學(xué)[J];國外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊);2000年02期

4 季碧霞;HLA:從分子到功能[J];國外醫(yī)學(xué).遺傳學(xué)分冊;2000年01期

5 于津浦,閆燕華;改善腫瘤抗原呈遞研制新型細胞瘤苗[J];國外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊);2000年03期

6 付清玲,李欣;危險模式與免疫耐受[J];國外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊);2000年02期

7 陳章國;細胞因子佐劑[J];國外醫(yī)學(xué).免疫學(xué)分冊;1995年03期

8 謝蜀生;腫瘤微環(huán)境與腫瘤疫苗[J];國外醫(yī)學(xué).免疫學(xué)分冊;1995年05期

9 錢振超;21世紀(jì)腫瘤免疫學(xué)面臨的挑戰(zhàn)與展望[J];上海免疫學(xué)雜志;2000年03期

10 萬謙,張朝良,翟朝陽;腫瘤的免疫治療[J];生物化學(xué)與生物物理進展;1999年02期

本文編號：2869593