乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)是一種嚴重危害人類健康的病原體。全球目前有超過3.5億的乙肝病毒攜帶者,約90%的嬰幼兒和5%的成年人在感染HBV后會發(fā)展為慢性感染,其中部分慢性HBV感染會進一步發(fā)展成肝硬化甚至肝癌。研究認為,HBV慢性持續(xù)性感染與宿主不能形成有效的抗病毒反應有關,但具體的機制并不十分明確。Toll樣受體(Toll-Like Receptors, TLRs)作為一種重要的模式識別受體在對抗病毒感染的過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。已有文獻報道,HBV在長期的進化過程中形成了多種拮抗TLRs反應的策略以逃逸機體的天然免疫反應,形成持續(xù)性的感染。本課題組前期的研究表明,慢性乙型肝炎感染患者外周血單個核細胞(PBMCs) TLR2和TLR4配體誘導的細胞因子產生能力受損,并且其細胞因子的產生能力與外周血中的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)濃度呈負相關,提示HBsAg在抑制TLR2和TLR4配體誘導細胞因子產生中發(fā)揮重要的作用。為了確認HBsAg抑制TLR2和TLR4配體誘導的細胞因子產生的現(xiàn)象并探索其中的具體機制,本課題使用THP-1巨噬細胞模型進行了深入的研究。首先研究了HBsAg對TLR2和TLR4介導細胞因子產生的影響,發(fā)現(xiàn)HBsAg可以以劑量依賴性的方式抑制TLR2介導的IL-12的產生,對IL-6、IL-8、TNF-α和IL-10沒有明顯影響。與對TLR2的影響有所不同,HBsAg在顯著抑制TLR4介導的IL-12的同時,亦對II-6及TNF-α的產生也有明顯抑制作用。TLR2與TLR4中的NF-κB通路與MAPK通路是調節(jié)細胞因子產生的主要通路,研究發(fā)現(xiàn)與選擇性抑制TLR2介導的IL-12產生相對應的是HBsAg只選擇性的抑制了MAPK-JNK通路的激活,對NF-kB、MAPK-p38及MAPK-ERK通路的激活沒有明顯影響,而對于TLR4,HBsAg除能顯著抑制MAPK-JNK通路激活外,亦對NF-κB通路、MAPK-p38通路激活有普遍的抑制。由于目前已有研究表明HBsAg可以通過影響TLR4介導NF-KB通路和MAPK通路抑制TNF-α等細胞因子的產生,而HBsAg對TLR2信號通路的影響尚未有相關報道,為此主要集中于HBsAg抑制TLR2介導的IL-12產生的機制研究。IL-12是一種在抗病毒反應中極為重要的細胞因子,HBsAg選擇性的抑制TLR2介導的IL-12的產生及JNK通路的激活,提示JNK通路的激活與IL-12的產生密切相關。分析表明,IL-12啟動子上有JNK激酶下游轉錄因子c-Jun的結合位點,表明JNK在調節(jié)IL-12產生中發(fā)揮重要作用,本課題使用JNK磷酸化的特異性抑制劑SP600125,發(fā)現(xiàn)其能特異性抑制JNK的激活及IL-12的產生,間接證明了HBsAg通過影響TLR2介導的JNK的磷酸化從而抑制IL-12的產生。除THP-1巨噬細胞外,本研究從健康人PBMC中分離出單核細胞并分化為巨噬細胞,發(fā)現(xiàn)HBsAg對人巨噬細胞中TLR2介導的JNK的磷酸化及IL-12產生也具有顯著抑制作用。此外,本課題收集了23例慢性乙肝患者及16例健康志愿者的外周血樣本,檢測比較了PBMC及CD14+單核／巨噬細胞中TLR2介導的JNK激活及IL-12產生情況,發(fā)現(xiàn)與健康志愿者相比,慢性乙肝患者PBMC及CD14+單核／巨噬細胞中TLR2介導JNK的激活及IL-12的產生能力受損,進一步驗證了HBsAg對TLR2通路的抑制效應。無論對于TLR2還是對于TLR4, HBsAg具體如何抑制NF-κB通路和MAPK通路的激活,目前還不清楚。為此本課題進一步研究了HBsAg抑制TLR2和TLR4信號通路的作用環(huán)節(jié)及分子機制。首先發(fā)現(xiàn)HBsAg可以在一定程度上影響TLR2和TLR4細胞膜上受體的表達,另外也發(fā)現(xiàn)HBsAg可以以甘露糖受體依賴性的方式被巨噬細胞有效的內吞,使用內吞抑制劑及甘露糖阻斷HBsAg進入細胞后,發(fā)現(xiàn)HBsAg的抑制作用被顯著削弱,表明除下調受體外,HBsAg主要通過進入巨噬細胞發(fā)揮抑制作用。SHP-1/Src是一對重要的蛋白酪氨酸磷酸酶和蛋白酪氨酸激酶,在TLRs傳導過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。本研究通過使用SHP-1和Src的抑制劑,發(fā)現(xiàn)SHP-1和Src對THP-1巨噬細胞中TLR2和TLR4介導的JNK激活及IL-12產生有重要的正調控作用,進一步研究發(fā)現(xiàn)HBsAg可以顯著抑制Src的激活,提示HBsAg進入細胞后可能通過影響SHP-1/Src從而抑制TLR2和TLR4介導的信號通路激活及細胞因子的產生。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)HBsAg對TLR2介導的IL-12產生具有選擇性抑制的作用,而對TLR4介導的細胞因子產生及信號通路的激活則具有普遍性抑制作用；在THP-1巨噬細胞、人巨噬細胞及慢性HBV感染患者臨床標本等多個層面上,本研究證實HBsAg可以對JNK激活及IL-12產生的抑制。此外,本研究還進一步提出了HBsAg通過進入細胞并影響SHP-1/Src進而抑制TLR2和TLR4信號通路激活及細胞因子產生的可能機制。上述研究有利于豐富人們對病毒拮抗細胞內信號傳導機制的認識,也為開發(fā)新型抗HBV治療藥物提供了新的理論和實驗依據。
【學位單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2014
【中圖分類】：R373.21
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
前言
材料與方法
結果
討論
結論
創(chuàng)新點
參考文獻
文獻綜述
    參考文獻
附錄1 H7N9感染患者細胞因子表達水平的研究
附錄2
附件
致謝

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本文編號：2864991