凝血障礙是導(dǎo)致出血性疾病的重要原因，凝血過程的激活在血栓形成中也具有極為重要的作用。本研究通過對(duì)部分凝血因子的基因突變和多態(tài)性研究，一方面探討了遺傳出血性疾病血友病A和FⅫⅠ缺乏癥的分子機(jī)制，另一方面研究了凝血因子Ⅱ、Ⅴ和ⅫⅠ的多態(tài)FⅡ20210A、FⅤLeiden和FⅫⅠ-A V34L在加拿大紐芬蘭人群和中國臺(tái)灣人群中的分布頻率以及與心肌梗死發(fā)病的相關(guān)性。 血友病A(hemophilia A)是最為常見的遺傳性出血性疾病，發(fā)病率約為1／5000男性，為X連鎖隱性遺傳。已發(fā)現(xiàn)FⅧ基因的缺陷種類800多種。 先天性凝血因子ⅫⅠ缺乏癥(Congenital Factor ⅫⅠ Deficiency)是一種少見但嚴(yán)重的常染色體隱性遺傳的出血疾病，絕大多數(shù)是由于FⅫⅠA亞單位缺陷導(dǎo)致的。FⅫⅠ缺乏癥是高度的遺傳異質(zhì)性疾病，全世界有200多例報(bào)告，共計(jì)突變類型47種。 心肌梗死(myocardial infarction，MI)是冠心病的結(jié)局之一。在這一發(fā)病過程中，冠狀內(nèi)血栓形成對(duì)MI的發(fā)生發(fā)展起重要作用。 Factor V Leiden(FVL，F(xiàn)V R506Q)和凝血酶原20210G＞A(FⅡ 20210G＞A)的變異是兩個(gè)普遍認(rèn)為的靜脈血栓形成的遺傳促凝血高危因子。這兩個(gè)基因的變異是否與MI發(fā)生中的動(dòng)脈血栓形成相關(guān)也得到了人們的關(guān)注，而另一普遍的基因變異FⅫⅠ-AVal34Leu被認(rèn)為可能起到預(yù)防MI的作用，但也有相反的報(bào)告。 加拿大紐芬蘭和拉博道省(Newfoundland Labrador)所在島嶼位于加拿大東海岸，島上人群主要來自17與18世紀(jì)英國和愛爾蘭移民的后裔。由于該島地理與社會(huì)的隔離使得幾百年來很少內(nèi)部遷徙，從而導(dǎo)致島內(nèi)人群遺傳隔離。 我們發(fā)現(xiàn)在紐芬蘭和拉博道省偏遠(yuǎn)地區(qū)Twilligate和Forteau有高發(fā)的輕型血友 鄭州大學(xué)博士研究生論文 遺傳性出血疾病與血栓相關(guān)疾病的分子生物學(xué)研究 病A，這些患者的家族史使我們可以把Twilligate的所有患者聯(lián)系在一個(gè)跨越10代 的包括1630個(gè)家族成員的大家族，而Forteau的患者則聯(lián)系在一個(gè)跨越6代的約567 個(gè)成員的家族。在Twilligate中發(fā)病為約44/3 300男性，在Forteau發(fā)病為約14/ 260男性。 我們還發(fā)現(xiàn)在紐芬蘭和拉博道省FXlll缺乏癥的發(fā)病率在全加拿大最高。己經(jīng)確 認(rèn)了來自3個(gè)家庭的5個(gè)患者。 該人群的高發(fā)輕型血友病A和FXlll缺乏癥極大可能來自一個(gè)或很少幾個(gè)方德 突變(founder mutation)。對(duì)此進(jìn)行研究將有助于對(duì)患者早期診斷、治療及精確檢出 表型正常的高危攜帶者，對(duì)改善當(dāng)?shù)厝巳旱纳眢w健康有著重大的臨床意義。 作為一多因素疾病，Ml的遺傳基礎(chǔ)可能是一系列基因的聯(lián)合作用，一般進(jìn)行基 因與基因間相互作用的研究中常遇到的問題是相對(duì)樣本量較小，基因變異頻率低， 調(diào)查人群的種族異質(zhì)性等。為克服這些弱點(diǎn)，我們?cè)谶z傳隔離的紐芬蘭人群中選取 500MI患者和500正常個(gè)體同時(shí)進(jìn)行FVL、Fll 20210G)A和FXlll一A、乞134Leu的研 究。 FVLe記en、Fll20210GA和FXHI~AV34L的發(fā)生存在著世界性的地理異質(zhì)性和 種族差異分布，為確定其在中國人群中的分布，我們對(duì)取自中國臺(tái)灣的較大樣本(500) 進(jìn)行FVL、Fll ZOZ10GA和Fxm一A Leu34基因型頻率和基因頻率的研究，并與加 拿大紐芬蘭高加索人群的分布頻率進(jìn)行比較，為進(jìn)一步對(duì)其與血栓形成的相關(guān)性研 究提供理論依據(jù)。 方法:我們從Twilligate群體中選擇采集了36份血樣，另外還有4名明顯無親緣關(guān) 系的周圍50英里外的英國倫敦的輕型血友病患者的血樣。隨后，又在當(dāng)?shù)厝巳翰杉?了部分血樣進(jìn)行篩查，先后共檢測(cè)基因組DNA94份，包括患者36人，攜帶者29人， 正常29人。在紐芬蘭省其他地區(qū)隨機(jī)選取了包括67條X染色體的正常人基因組 DNA。 我們亦從Forteau人群中選擇采取了4份血樣，包括患者2人，肯定攜帶者1 人，可疑攜帶者1人。 在FXm缺乏癥的研究中，我們采集了經(jīng)臨床確診為FXlll缺乏癥的來自三個(gè)家 庭的5名患者的血樣。 在血友病A的研究中，以高鹽法提取基因組DNA。PCR引物設(shè)計(jì)為擴(kuò)增全部 FVnl基因編碼區(qū)、剪接位點(diǎn)和5’、3‘非編碼區(qū)。應(yīng)用構(gòu)象敏感凝膠電泳(CSGE) 和突變檢出強(qiáng)化(MDETM)電泳對(duì)兩名患者的所有PcR產(chǎn)物進(jìn)行異二倍性分析的突 鄭州大學(xué)博士研究生論文 遺傳性出血疾病與血栓相關(guān)疾病的分子生物學(xué)研究 變篩查，對(duì)顯示突變帶的部分進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用MDETM結(jié)合位點(diǎn)特異PcR(AsP)對(duì) 確認(rèn)突變進(jìn)行群體普查。 在FXnl缺乏癥的研究中，PCR引物設(shè)計(jì)為擴(kuò)增全部FXmA基因編碼區(qū)和剪接 位點(diǎn)。應(yīng)用MDETM電泳對(duì)5名患者的所有PcR產(chǎn)物進(jìn)行異二倍性分析的突變篩查， 接著對(duì)所有巧個(gè)外顯子的PCR產(chǎn)物進(jìn)行了直接測(cè)序。應(yīng)用TSP509I酶切進(jìn)行了突 變驗(yàn)證。 在基因多態(tài)與血栓的相關(guān)性研究中，應(yīng)用復(fù)合PCR擴(kuò)增法同時(shí)擴(kuò)增FV基因第 5外顯子和Fll基因第14外顯子及3‘非翻譯區(qū)，限制性內(nèi)切酶Hind 111和Mnll雙 消化，PCR擴(kuò)增FXm第2外顯子，限制性內(nèi)切酶Ddel消化，10%聚丙烯酞胺凝膠 電泳分離，EB染色。 結(jié)果:對(duì)兩名來自Twilligate的患者的csGE分析和MDETM膠分析均顯示Fvin基 因第19外顯子有突變帶。測(cè)序結(jié)果顯示在ni6047位有一T~C轉(zhuǎn)換，相應(yīng)于第2016 密碼子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)此位點(diǎn)的擷氨酸(GTG)被丙氨酸(GcG)替換。?
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

由于DNA不相配的區(qū)域形成“紐結(jié)”(kink)，由一條突變鏈和一條野生型鏈組成的異二倍型DNA在MDE膠上則有不同的遷移速率。這樣就可把異二倍型DNA和純合二倍型DNA分離開來(圖1一2)。圖1一2MDE膠異二倍型分析原理

表卜3)

130個(gè)圖2一比患者引物2測(cè)序結(jié)果為進(jìn)一步確認(rèn)這一突變，應(yīng)用TsP509I酶切，突變附近正常序列為AGTT，沒有該酶切點(diǎn)，得到349bp和43bp的片段，突變?yōu)锳ATT，得到23obp，119bp
【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2864024