比格犬因其性情溫順，體格適中，遺傳背景清晰，均質(zhì)性好，在醫(yī)藥、公共衛(wèi)生、生命科學(xué)和軍事醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，發(fā)揮著重要的作用。但目前，我國比格犬種群內(nèi)的不發(fā)情或發(fā)情不孕、休情期延長、停發(fā)情、窩產(chǎn)仔數(shù)少等情況比較常見，嚴(yán)重制約著比格犬的生產(chǎn)效率，因此，針對比格犬生殖調(diào)控機(jī)理的研究具有重要的理論與實(shí)際意義。本研究對不同發(fā)情階段比格犬卵巢與子宮內(nèi)雌激素受體ERα、ERβ蛋白的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了研究，并對犬ERα、ERβ及可能存在的ERβ剪接異構(gòu)體進(jìn)行基因擴(kuò)增，構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒，并瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，對其活性進(jìn)行初步研究。突出的結(jié)果是首次發(fā)現(xiàn)了比格犬ERβ的四個剪接異構(gòu)體，為深入進(jìn)行比格犬ERα、ERβ及其剪接異構(gòu)體在生殖調(diào)控中的作用機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)�，F(xiàn)將實(shí)驗研究報告如下。 1.間情期與發(fā)情期比格犬血清性激素檢測及卵巢與子宮正常組織形態(tài)的比較 應(yīng)用病理切片技術(shù)對間情期及發(fā)情期比格犬卵巢及子宮的正常組織形態(tài)進(jìn)行比較，并對兩個發(fā)情階段比格犬血清性激素：E2、PRGE、FSH和LH水平進(jìn)行測定，分析其性激素變化特點(diǎn)和卵巢、子宮在不同階段的組織形態(tài)學(xué)特征。 性激素檢測結(jié)果表明：在發(fā)情期比格犬出現(xiàn)了很明顯的E2峰值，而在間情期及發(fā)情后期雌激素均維持在極低的水平。而PRGE在間情期未能檢測到，在發(fā)情期及發(fā)情后期均能檢出，并且在發(fā)情后期表達(dá)水平明顯升高。 組織形態(tài)學(xué)比較結(jié)果表明：間情期犬子宮及其內(nèi)膜較薄，間質(zhì)纖維增生，黃體中以初級卵泡為主，可見1-2個次級卵泡，未見成熟卵泡，卵泡和黃體細(xì)胞間纖維較多、血管少。發(fā)情期犬子宮及其內(nèi)膜增厚，內(nèi)膜腺體腔較大，部分腺體呈分枝狀彎曲，腺上皮腫大，胞漿淡染，少數(shù)可見核下空泡。卵巢中卵泡數(shù)量較多，有初級、次級和1-2個成熟卵泡。黃體細(xì)胞數(shù)量多，排列規(guī)則，境界清楚，間質(zhì)纖維比較疏松，血管多，未見空泡變性。 2.間情期與發(fā)情期比格犬卵巢與子宮內(nèi)ERα、ERβ的定位與定量研究 運(yùn)用免疫組織化學(xué)和圖像灰度分析法對間情期與發(fā)情期比格犬卵巢及子宮內(nèi)ERα、ERβ蛋白的表達(dá)進(jìn)行組織定位和半定量分析，結(jié)果如下： ⑴比格犬ERα、ERβ的免疫組織化學(xué)定位 ERα主要表達(dá)于卵泡顆粒細(xì)胞、卵巢間質(zhì)腺腺上皮細(xì)胞胞核內(nèi)，胞質(zhì)內(nèi)有微弱表達(dá)，卵母細(xì)胞胞核及卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)也有表達(dá)，在卵泡膜內(nèi)膜的間質(zhì)細(xì)胞及小動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞、小靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的胞核內(nèi)也有少量表達(dá)。在膜黃體細(xì)胞的胞核，顆粒黃體細(xì)胞的胞核與胞質(zhì)內(nèi)均有表達(dá)。 ERβ主要表達(dá)于卵泡顆粒細(xì)胞，卵巢間質(zhì)腺的腺上皮細(xì)胞及顆粒黃體細(xì)胞的核膜及胞質(zhì)內(nèi)，少量表達(dá)于卵巢間質(zhì)動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞、靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的核膜及胞質(zhì)內(nèi)。 ERα主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺體細(xì)胞胞核內(nèi)，而ERβ主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺體細(xì)胞核膜及胞質(zhì)，在血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)也有表達(dá)。 BCIP/NBT與AEC雙染可見ERα、ERβ在子宮內(nèi)可表達(dá)于同一個內(nèi)膜腺體細(xì)胞，但其定位部位不同：ERα主要在核內(nèi)，而ERβ主要在核膜及胞質(zhì)內(nèi)。 ⑵ERα、ERβ半定量分析結(jié)果 間情期與發(fā)情期比格犬卵巢內(nèi)各組成成份ERα蛋白的表達(dá)特點(diǎn)：間情期與發(fā)情期比格犬卵巢內(nèi)腺體、卵泡及周圍基質(zhì)、黃體各組份ERα表達(dá)的變化以腺體（0.03297±0.004075vs0.06647±0.008961，P＜0.01）和黃體（0.01286±0.003219vs0.06241±0.007671，P＜0.01）為顯著，在發(fā)情期的表達(dá)水平均較間情期顯著增加。表明ERα蛋白主要表達(dá)于發(fā)情期卵巢腺體及黃體內(nèi)。 間情期與發(fā)情期比格犬卵巢內(nèi)各組成成份ERβ蛋白的表達(dá)特點(diǎn)：由間情期發(fā)展至發(fā)情期，比格犬卵巢生長卵泡、初級卵泡、黃體、間質(zhì)血管各組份中，生長卵泡ERβ表達(dá)水平顯著增加（0.04471±0.004291vs0.1300±0.03970，P＜0.01），黃體內(nèi)ERβ表達(dá)水平顯著下降（0.1515±0.02711vs0.1008±0.02247，P＜0.01），但黃體內(nèi)ERβ的起始表達(dá)水平很高，與初級卵泡及間質(zhì)血管中的表達(dá)水平（0.01879±0.001484）比較仍保持在較高的水平。初級卵泡及卵巢間質(zhì)血管中ERβ保持在相對較低的水平。表明在卵巢內(nèi)ERβ蛋白主要表達(dá)于生長卵泡及黃體內(nèi)。 間情期與發(fā)情期比格犬ERα、ERβ蛋白在卵巢內(nèi)的表達(dá)特點(diǎn)：在間情期及發(fā)情期比格犬卵巢內(nèi)ERβ的表達(dá)水平顯著高于ERα（間情期：0.08646±0.008002vs0.02398±0.001911，P＜0.01；發(fā)情期：0.09007±0.007534vs0.04691±0.003052，P＜0.01）比格犬卵巢內(nèi)ERα在由間情期發(fā)展至發(fā)情期時表達(dá)水平顯著增加（0.02398±0.001911vs0.04691±0.003052，P＜0.01），而ERβ在兩個生理階段基本保持不變（0.08646±0.008002vs0.09007±0.007534，P＞0.05），但與ERα比較，維持在較高的表達(dá)水平。說明在間情期與發(fā)情期卵巢內(nèi)均以ERβ的表達(dá)占主導(dǎo)地位。 間情期與發(fā)情期比格犬ERα、ERβ蛋白在子宮內(nèi)的表達(dá)特點(diǎn)：在比格犬子宮內(nèi)，在間情期，ERα、ERβ都有表達(dá)，但都維持在相對較低的水平，并且兩者的表達(dá)水平無顯著差異（0.02855±0.008855vs0.02908±0.003865，P＞0.05），而發(fā)展至發(fā)情期時， ERα的表達(dá)水平顯著增加（0.02855±0.008855vs0.04896±0.006833，P＜0.01），ERβ仍維持在相對較低的水平（0.02170±0.003959）。由此得出結(jié)論在發(fā)情期比格犬子宮內(nèi)，ERα為優(yōu)勢表達(dá)的雌激素受體亞型。 3. ERα、ERβ及ERβ新剪接異構(gòu)體的擴(kuò)增與鑒定 應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增了ERα和ERβ的全長編碼序列：ERα1791和ERβ1593，并首次篩選出了ERβ的四個選擇性剪接異構(gòu)體：第4外顯子完整缺失的一個；第7外顯子完整缺失的一個；部分第4和部分第5外顯子組合缺失的兩個。應(yīng)用5`3`RACE對第4外顯子完整缺失的ERβ1293及第7外顯子完整缺失的ERβ1257兩個剪接異構(gòu)體擴(kuò)增出其全長編碼序列。ERα1791分子量為66kD，ERβ1593分子量為59kD；ERβ1293缺失300bp，編碼430aa，分子量為48kD；ERβ1257缺失181bp，編碼418aa，分子量為47kD，堿基的缺失造成了讀碼移位，使翻譯提前終止，在其終止密碼子前插入10個非編碼ERβ氨基酸殘基。訖今，我們尚未查到關(guān)于比格犬ERβ的剪接異構(gòu)體的研究報道。本實(shí)驗首次發(fā)現(xiàn)比格犬ERβ的四個剪接異構(gòu)體，擴(kuò)增出其中兩個的全長編碼序列，并且證明其在瞬時轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中能夠翻譯成蛋白質(zhì)。 4. ERα、ERβ及ERβ剪接異構(gòu)體真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建及活性的初步研究 構(gòu)建了pEGFP-n1-ERα1788，pEGFP-n1-ERβ1590，pEGFP-n1-ERβ1290，pEGFP-n1-ERβ1254真核表達(dá)重組質(zhì)粒，瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)WB驗證ERα1788、ERβ1590、ERβ1290、ERβ1254在體外均能翻譯成目的蛋白質(zhì)。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R3416
【部分圖文】：

e. 間情期犬未成熟卵泡（HE4×）；f. 發(fā)情期犬成熟卵泡（HE4×）；g.間情期犬黃體細(xì)胞空泡變性（HE10×）；h. 發(fā)情期犬黃體（HE 10×）；i. 間情期犬卵巢間質(zhì)纖維（HE10×）；j. 發(fā)情期犬卵巢間質(zhì)纖維（HE10×）圖 1 間情期與發(fā)情期比格犬子宮與卵巢組織形態(tài)學(xué)e. Diestrus canine immature follicles (HE 4×); f. Estrus canine mature follicles (HE 4×);g. Diestrus canine luteal cell vacuolar degeneration (HE 10×); h. Esterus canine corpus luteu(HE 10×); i. Diestrus canine ovarian interstitial fibrosis (HE 10×); j. Estrus canine ovariainterstitial fibrosis (HE 10×).Fig. 1 Uterine and ovarian morphology of diestrus and estrus beagle dogs3．討論犬為季節(jié)性單次發(fā)情，1年只發(fā)情1次，發(fā)情期所持續(xù)時間為1周左右，但由于馴化時間較長，家犬已經(jīng)不再1年只發(fā)情1次。母犬的發(fā)情周期分為發(fā)情前期發(fā)情期、發(fā)情后期和休情期，各期特征如下：發(fā)情前期：通常為5～10天，范圍2～20天，此期母犬外陰部紅腫，從陰道排出血性粘液；發(fā)情期：開始于排卵前36～

第三章 比格犬 ERα、ERβ基因擴(kuò)增及 ERβ可能的剪接異構(gòu)體的篩查0μl 槍頭挑取平板上的菌落于 3-5ml 含有相應(yīng)抗性的 LB 液體培養(yǎng)恒溫?fù)u床，220rpm，振蕩培養(yǎng) 12-16h； PCR 鑒定α 擴(kuò)增基因的菌液 PCR 鑒定反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同其目的基因的板更換為菌液。β 擴(kuò)增基因的菌液 PCR 鑒定反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同其目的基因的板更換為菌液。能的兩個外顯子缺失異構(gòu)體擴(kuò)增基因篩查的菌液鑒定，反應(yīng)體系其目的基因的擴(kuò)增，僅將模板更換為菌液。犬下丘腦、垂體、卵巢、子宮組織總 RNA 的提取丘腦，垂體，卵巢，子宮組織總 RNA 提取結(jié)果如圖 1a-圖 1b

組織 總 RNA 濃度 ng/μl A260/A280 A下丘腦 1714.8 1.98 垂體 1161.7 1.97 卵巢 3489.5 1.99 子宮 4611.4 1.96 卵巢 711.2 1.99 子宮 806.4 1.98 下丘腦 795.8 1.95 垂體 209.7 2.00 結(jié)果主帶的擴(kuò)增RT-PCR 擴(kuò)增 cDNA 為模板擴(kuò)增出 ERα 主帶，產(chǎn)物長度為 1788bp（去如圖 2。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2863760