細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間存在著復(fù)雜的聯(lián)系,細(xì)胞表面的受體與細(xì)胞外微環(huán)境相互作用,決定了細(xì)胞的粘附、增殖、遷移、分化,以及特異性功能表達(dá)。近年來,組織工程和再生醫(yī)學(xué)的研究取得了重要的進(jìn)展,為各領(lǐng)域的研究拓寬了一條新的途徑。利用生物材料、醫(yī)用材料等仿生構(gòu)建細(xì)胞外微環(huán)境的應(yīng)用已經(jīng)成為生物材料領(lǐng)域研究的重點(diǎn),其中,以基因工程技術(shù)為基礎(chǔ)的新型生物材料---融合蛋白的研制已成為設(shè)計(jì)和構(gòu)建細(xì)胞外微環(huán)境生物材料研究的新方向。本論文通過生物合成人E-鈣粘素融合蛋白,研究開發(fā)仿生細(xì)胞-細(xì)胞間相互作用的生物材料,并仿生構(gòu)建細(xì)胞外微環(huán)境調(diào)控細(xì)胞行為,其不僅能有效推動基礎(chǔ)生物學(xué)的研究,同時在組織工程和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用。 首先,我們重組了人細(xì)胞間粘附分子E-鈣粘蛋白(hE-cadherin)的胞外域與免疫球蛋白G(IgG)的Fc域,生物合成人E-鈣粘素融合蛋白(hE-cadherin-Fc)�；蚬こ碳夹g(shù)構(gòu)建了融合蛋白表達(dá)載體,利用293F細(xì)胞表達(dá)體系進(jìn)行了融合蛋白的表達(dá)并純化,Elisa和western blotting檢測表明我們成功制備了高純度的hE-cadherin-Fc。進(jìn)一步將融合蛋白應(yīng)用于疏水材料的表面修飾,仿生構(gòu)建了細(xì)胞-細(xì)胞間相互作用的生物材料細(xì)胞外微環(huán)境并用于人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)的增殖及定向分化研究。接觸角(WCA)及原子力顯微鏡(AFM)檢測表明：hE-cadherin-Fc能夠利用Fc結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定的吸附在疏水材料表面,同時改善了材料表面的形態(tài)及親水性,形成穩(wěn)定的細(xì)胞外基質(zhì)。與組織細(xì)胞培養(yǎng)板(TC-PS)和明膠(Gelatin)基質(zhì)相比,hE-cadherin-Fc基質(zhì)能顯著增強(qiáng)hMSCs的粘附,并促進(jìn)細(xì)胞增殖；同時未分化性標(biāo)志物CD105的流式細(xì)胞術(shù)鑒定顯示：hMSCs保持了良好的未分化性。hE-cadherin-Fc基質(zhì)對hMSCs生物學(xué)行為的調(diào)控及其分子機(jī)制的進(jìn)一步研究,發(fā)現(xiàn)融合蛋白基質(zhì)顯著提高了E鈣粘素信號通路的相關(guān)分子表達(dá)水平,初步揭示了在細(xì)胞培養(yǎng)初期hE-cadherin-Fc基質(zhì)與細(xì)胞間的相互作用代替了細(xì)胞-細(xì)胞間的相互作用。 其次,我們考察了hE-cadherin-Fc基質(zhì)對hMSCs向肝細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的影響。在hE-cadherin-Fc基質(zhì)表面hMSCs向肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)4周后,細(xì)胞形態(tài)、肝特異性標(biāo)志物基因和蛋白的表達(dá)、肝細(xì)胞分化功能表達(dá)的檢測表明：不同基質(zhì)條件下hMSCs均有部分細(xì)胞分化成為肝細(xì)胞樣細(xì)胞,與TC-PS和Gelatin基質(zhì)相比,hE-cadherin-Fc基質(zhì)表面分化的肝細(xì)胞樣細(xì)胞表達(dá)肝前體細(xì)胞標(biāo)志物CD117的陽性細(xì)胞比例高于TC-PS和Gelatin基質(zhì)表面,并且肝細(xì)胞特異性標(biāo)志物基因白蛋白(ALB)、細(xì)胞角蛋白18(CK18)和肝細(xì)胞核因子4(HNF4)的分子水平表達(dá)量更高；ALB蛋白免疫熒光染色結(jié)果也證明了ALB蛋白表達(dá)與其分子表達(dá)水平相同的結(jié)果。同時,肝分化功能指標(biāo)糖原儲存、吲哚青綠(ICG)攝取、白蛋白和尿素分泌的檢測結(jié)果表明,hE-cadherin-Fc基質(zhì)顯著提高了人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源肝樣細(xì)胞分化功能的表達(dá)。本研究結(jié)果表明hE-cadherin-Fc基質(zhì)與相關(guān)液性因子協(xié)同作用促進(jìn)hMSCs向肝細(xì)胞定向跨胚層分化的潛能,其分子機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究,揭示了生物材料設(shè)計(jì)對其生物學(xué)功能的影響及應(yīng)用前景。 最后,我們進(jìn)一步探索了hE-cadherin-Fc用于納米纖維支架和多孔支架的生物功能改性的研究。掃描電子顯微鏡(SEM)的結(jié)果顯示,融合蛋白的修飾沒有改變支架的三維微納米結(jié)構(gòu)。X射線光電子能譜(XPS)和Elisa檢測結(jié)果表明,hE-cadherin-Fc在三維支架表面有效形成了穩(wěn)定的融合蛋白層。WCA結(jié)果顯示hE-cadherin-Fc表面修飾顯著改善了三維支架表面的親水性；同時,hE-cadherin-Fc基質(zhì)化提高了hMSCs在三維支架上的粘附與增殖。細(xì)胞骨架染色和細(xì)胞形態(tài)結(jié)果表明,在hE-cadherin-Fc表面改性支架內(nèi)的細(xì)胞更接近成纖維狀。此外,茜素紅染色表明hE-cadherin-Fc基質(zhì)表面擴(kuò)增的干細(xì)胞保持了良好的分化性能。本研究表明hE-cadherin-Fc可用于三維支架表面改性,提高支架與細(xì)胞的親和性,進(jìn)一步賦予支架生物功能,顯示了其在干細(xì)胞三維環(huán)境構(gòu)建及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景。 綜上所述,hE-cadherin-Fc融合蛋白可用于疏水材料的表面改性,由鈣粘素的同源結(jié)合介導(dǎo)細(xì)胞與材料粘附,通過生物材料模擬細(xì)胞間結(jié)合仿生構(gòu)建人工細(xì)胞外微環(huán)境,顯著改善干細(xì)胞粘附與增殖,并促進(jìn)干細(xì)胞定向分化調(diào)控,為生物材料在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用開辟了新的思路。
【學(xué)位單位】：南開大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R329.2
【文章目錄】：
摘要
Abstract
符號說明
第一章 前言
    第一節(jié) 組織工程的應(yīng)用和發(fā)展
        1.1.1 組織工程
        1.1.2 組織工程的構(gòu)成
        1.1.3 組織工程的發(fā)展
        1.1.4 組織工程存在的問題
    第二節(jié) 仿生細(xì)胞外微環(huán)境
        1.2.1 細(xì)胞外微環(huán)境
        1.2.2 生物材料仿生細(xì)胞外微環(huán)境
    第三節(jié) 細(xì)胞粘附
    第四節(jié) 種子細(xì)胞
        1.4.1 胚胎干細(xì)胞
        1.4.2 誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞
        1.4.3 間充質(zhì)干細(xì)胞
    第五節(jié) 本研究的設(shè)計(jì)思路、研究內(nèi)容、技術(shù)路線、目的意義及創(chuàng)新性
        1.5.1 設(shè)計(jì)思路
        1.5.2 研究內(nèi)容
        1.5.3 技術(shù)路線
        1.5.4 目的與意義
        1.5.5 本研究的創(chuàng)新性
第二章 人E一鈣粘素融合蛋白基質(zhì)對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附和增殖影響的研究
    第一節(jié) 引言
    第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料與儀器
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 人E-鈣粘素的基因序列的分析和克隆
        2.3.2 人E-鈣粘素融合蛋白克隆載體和表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.3.3 人E-鈣粘素融合蛋白的表達(dá)純化
        2.3.4 人E-鈣粘素融合蛋白修飾疏水表面的表征
        2.3.5 人E-鈣粘素融合蛋白吸附穩(wěn)定性的分析
        2.3.6 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)
        2.3.7 人E-鈣粘素融合蛋白基質(zhì)表面人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞粘附和增殖的鑒定
        2.3.8 人E-鈣粘素融合蛋白基質(zhì)表面細(xì)胞粘附的鈣離子依賴性分析
        2.3.9 人E-鈣粘素融合蛋白基質(zhì)表面人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)的分析及量化
        2.3.10 人E-鈣粘素融合蛋白基質(zhì)表面人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代分析
        2.3.11 人E-鈣粘素融合蛋白基質(zhì)表面人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞未分化性的分析
        2.3.12 人E-鈣粘素融合蛋白基質(zhì)表面人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分子水平表達(dá)的分析
        2.3.13 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
    第四節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.4.1 人E-鈣粘素融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
        2.4.2 人E-鈣粘素融合蛋白的表達(dá)純化及鑒定
        2.4.3 人E-鈣粘素融合蛋白基質(zhì)吸附濃度
        2.4.4 人E-鈣粘素融合蛋白修飾疏水表面
        2.4.5 人E-鈣粘素融合蛋白吸附的穩(wěn)定性
        2.4.6 人E-鈣粘素融合蛋白基質(zhì)表面人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附
        2.4.7 人E-鈣粘素融合蛋白細(xì)胞粘附的鈣離子依賴性
        2.4.8 人E-鈣粘素融合蛋白基質(zhì)表面人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)
        2.4.9 人E-鈣粘素融合蛋白基質(zhì)表面人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖
        2.4.10 人E-鈣粘素融合蛋白基質(zhì)表面人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
        2.4.11 人E-鈣粘素融合蛋白基質(zhì)表面人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的未分化狀態(tài)
        2.4.12 人E-鈣粘素融合蛋白基質(zhì)表面人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)信號通路的基因表達(dá)
        2.4.13 人E-鈣粘素融合蛋白基質(zhì)的作用機(jī)理
    第五節(jié) 討論
    第六節(jié) 本章小結(jié)
第三章 人E-鈣粘素融合蛋白基質(zhì)對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞定向分化影響的研究
    第一節(jié) 引言
    第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料與儀器
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 人E-鈣粘素融合蛋白基質(zhì)穩(wěn)定性的分析
        3.3.2 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化
        3.3.3 流式細(xì)胞術(shù)分析
        3.3.4 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化后分子水平的鑒定
        3.3.5 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化后蛋白水平的鑒定
        3.3.6 糖原染色分析
        3.3.7 ICG的攝取實(shí)驗(yàn)
        3.3.8 白蛋白測定
        3.3.9 尿素測定
        3.3.10 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
    第四節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.4.1 人E-鈣粘素融合蛋白基質(zhì)的穩(wěn)定性
        3.4.2 不同基質(zhì)表面人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞的定向分化
        3.4.3 不同基質(zhì)表面人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的效率
        3.4.4 不同基質(zhì)表面人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的肝特異性基因的表達(dá)
        3.4.5 不同基質(zhì)表面人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的肝特異性蛋白的表達(dá)
        3.4.6 不同基質(zhì)表面人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的糖原染色
        3.4.7 不同基質(zhì)表面人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的ICG攝取
        3.4.8 不同基質(zhì)表面人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化后肝功能的表達(dá)
    第五節(jié) 討論
    第六節(jié) 本章小結(jié)
第四章 人E-鈣粘素融合蛋白修飾PCL納米纖維支架對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞影響的研究
    第一節(jié) 引言
    第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料與儀器
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 取向性非取向性PCL納米纖維支架的制備
        4.3.2 掃描電子顯微鏡觀察
        4.3.3 X射線光電子能譜分析
        4.3.4 接觸角實(shí)驗(yàn)
        4.3.5 人E-鈣粘素融合蛋白在納米纖維支架表面吸附穩(wěn)定性的分析
        4.3.6 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在PCL納米纖維支架中粘附和增殖的鑒定
        4.3.7 細(xì)胞骨架染色
        4.3.8 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在PCL納米纖維支架中向成骨細(xì)胞的分化
        4.3.9 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
    第四節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.4.1 PCL納米纖維支架的形態(tài)
        4.4.2 PCL納米纖維支架的表面形態(tài)
        4.4.3 人E-鈣粘素融合蛋白基修飾PCL納米纖維支架的元素分析
        4.4.4 人E-鈣粘素融合蛋白修飾PCL納米纖維支架的親水性
        4.4.5 人E-鈣粘素融合蛋白在PCL納米纖維支架的吸附穩(wěn)定性
        4.4.6 人E-鈣粘素融合蛋白修飾PCL納米纖維支架后人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附
        4.4.7 人E-鈣粘素融合蛋白修飾PCL納米纖維支架后人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖
        4.4.8 人E-鈣粘素融合蛋白修飾PCL納米纖維支架后人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)
        4.4.9 人E-耗粘素融合蛋白修飾PGL納米纖維支架后人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化性
    第五節(jié) 討論
    第六節(jié) 本章小結(jié)
第五章 人E-鈣粘素融合蛋白修飾多孔支架對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞影響的研究
    第一節(jié) 引言
    第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料與儀器
        5.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法
        5.3.1 PCL、PLGA和PCL/PLGGA支架的制備
        5.3.2 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定與培養(yǎng)
        5.3.3 多孔支架的消毒處理
        5.3.4 人E-鈣粘素融合蛋白修飾多孔支架
        5.3.5 掃描電鏡觀察細(xì)胞在支架表面的粘附和生長
        5.3.6 人E-鈣粘素融合蛋白修飾多孔支架后人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附和增殖
        5.3.7 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
    第四節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.4.1 多孔支架的形態(tài)
        5.4.2 人E-鈣粘素融合蛋白修飾多孔支架后人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附
        5.4.3 人E-鈣粘素融合蛋白修飾多孔支架后人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖
        5.4.4 人E-鈣粘素融合蛋白修飾多孔支架后人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)
    第五節(jié) 討論
    第六節(jié) 本章小結(jié)
第六章 全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
個人簡歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果

【共引文獻(xiàn)】

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6 孫凱;TGF-β_3誘導(dǎo)大鼠前軟骨干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞特性方向分化及其在KLD-12自組裝肽納米凝膠中的培養(yǎng)[D];華中科技大學(xué);2010年

7 周麗斌;應(yīng)用內(nèi)置式弧形牽張器修復(fù)下頜骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2006年

8 趙彥濤;幾種納米羥基磷灰石材料的合成與生物相容性研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2006年

9 單秀莉;大鼠脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞三維立體培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究[D];山東大學(xué);2006年

10 王樂禹;自人體脂肪組織分離與培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞及磷脂酰膽堿對體外培養(yǎng)的人脂肪細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2006年

本文編號：2861527