以總RNA中的mRNA構(gòu)建的cDNA表達文庫理論上含有該生物體的所有表達基因，可表達與天然蛋白相似的重組蛋白。建立cDNA表達文庫在一次永久保存基因資源的同時，可以利用功能篩選、免疫學(xué)篩選、藥物探針篩選、Southern雜交和大規(guī)模序列測定等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)尋找特異性活性蛋白基因，進而克隆和表達這些基因，對從核酸及蛋白質(zhì)等分子水平研究瘧原蟲的生命活動規(guī)律，對揭示其抗藥性分子機理，搞清某些特效藥物結(jié)合蛋白的基因及此類藥物的作用機制，對新型抗瘧藥物的合理設(shè)計及篩選都具有極其重要的現(xiàn)實意義。 青蒿素是從傳統(tǒng)中草藥菊科植物黃花蒿中分離出的一種具有內(nèi)過氧橋結(jié)構(gòu)的倍半帖內(nèi)酯。青蒿素類藥物是一種與已知抗瘧藥如氯喹等完全不同的新型化合物。大量藥理及臨床研究證明青蒿素類藥物是優(yōu)于氯喹的抗瘧新藥，具有速效、低毒、高效等特點。1991年Meshnick等人提出了青蒿素類藥物作用的二步機制假說：首先瘧原蟲體內(nèi)血紅蛋白的降解產(chǎn)物-亞鐵血紅素與青蒿素結(jié)合，激活青蒿素，催化內(nèi)過氧橋裂解形成一個以碳原子為中心的自由基；然后自由基與亞鐵血紅素和蟲體內(nèi)一些特異性蛋白結(jié)合而起作用。青蒿素類藥物可以選擇性地烷化蟲體內(nèi)一些含量較低的蛋白，并且這種烷化作用依賴內(nèi)過氧橋，但并不烷化未感染紅細胞內(nèi)的蛋白。雖然目前還沒有直接證據(jù)表明蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)烷化是蟲體致死的原因，但烷化蛋白與青蒿素類藥物抗瘧作用有關(guān)是很明顯的。 Tanaka等建立了一種新奇、快速、方便的分離藥物靶標蛋白基因的療法：drug-western法。即利用標記分子與藥物結(jié)合作為探針，直接從cDNA表達文庫篩選藥物結(jié)合蛋白的基因并分離和體外表達，以便獲取目的蛋白進行結(jié)構(gòu)和功能研究。與傳統(tǒng)分離方法相比，其最大的優(yōu)點是不需純化而直接確認靶受體痕量蛋白基因。 翻譯控制腫瘤蛋白最初在小鼠腫瘤細胞中被發(fā)現(xiàn)，是一個受翻譯過程所阻遏并與腫瘤生長相關(guān)的蛋白質(zhì)，隨后在酵母及植物和除腎細胞外的各種動物組織正常細胞中被發(fā)現(xiàn)。從植物到動物的各類細胞中，TCTP都有廣泛的高 度同源性和高度保守性，提示TCTP在細胞中有重要的生物學(xué)功能。雖然報道 認為TCTP具有鈣結(jié)合、金屬內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)、作為IgE依賴性 組胺釋放因子等功能，但其具體生物學(xué)功能尚待進一步研究闡明。 Bhisutthibhan等把感染惡性瘧原蟲的紅細胞與恤標記的雙氫青篙素共培養(yǎng)， 發(fā)現(xiàn)幾種特異性蛋白被標記，其中之一是TCTP。Walker于2000年在研究嚙 齒類動物感染的約氏瘧原蟲對青篙素藥物的抗性實驗中發(fā)現(xiàn)，約氏瘧原蟲抗 性系中TCTP過表達，表達量是敏感系的2.5倍，據(jù)此，他們認為TCTP可能 是青篙素類藥物靶標之一。 正是基于以上目的和研究背景，我們構(gòu)建了惡性瘧原蟲海南株紅內(nèi)期 cDNA表達文庫。把青篙素類衍生物:12B一二氫青篙素(4’一氧乙酸基)苯醚 用BsA標記作為探針，對惡性瘧原蟲海南株cDNA表達文庫篩選，分離出插入 了惡性瘧原蟲海南株TCTP基因的陽性單克隆。對惡性瘧原蟲海南株TCTP基 因進行了克隆和表達，為進一步研究奠定了基礎(chǔ)。 構(gòu)建惡性瘧原蟲海南株紅內(nèi)期CDNA表達文庫提取紅內(nèi)期惡性瘧原蟲 海南株總RNA，直接以總RNA為模板使用cDNA文庫構(gòu)建試劑盒，首先反轉(zhuǎn)錄 合成ss一DNA，再擴增合成ds一DNA(cDNA)，對擴增產(chǎn)物用蛋白酶K消化及左Z丁 I酶切，抽提蛋白、去除RNA后，用玻璃奶試劑盒純化、回收20Obp以上的 片斷，經(jīng)與載體連接再用蛋白包裝物包裝后形成未擴增文庫，最后擴增完成惡 性瘧原蟲海南株紅內(nèi)期cDNA表達文庫的構(gòu)建。所構(gòu)建的cDNA表達文庫滴度 為1.76x109，重組率達到90%。 Drug一乳stern法篩選惡性瘧原蟲海南株cDNA表達文庫文庫擴增后 使噬菌體噬斑轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，經(jīng)漂洗后，用膠聯(lián)劑EDC把青篙素類衍生物: 12乃一2氫青篙素(4’一氧乙酸基)苯醚與BSA連接作為探針與膜雜交，然后 依次與抗BSA抗體，辣根過氧化物酶標記的二抗共孵育，最后以增強化學(xué)發(fā) 光系統(tǒng)檢測，使X光片感光。通過X光片上的感光斑點確定PVDF膜的相應(yīng)位 置，再根據(jù)PvDF膜的相應(yīng)位置找到培養(yǎng)皿上的對應(yīng)噬菌體噬斑，挑取單噬斑 噬菌體擴增，經(jīng)二次篩選除去假陽性，最終篩選出陽性單克隆噬菌體。對陽 性單克隆噬菌體人DNA純化，經(jīng)DNA測序并登陸美國GenBank國際基因庫檢 索，發(fā)現(xiàn)在一個陽性單克隆中插入了惡性瘧原蟲TCTP基因。 惡性瘧原蟲海南株TCTP基因的克隆及其在M15中的表達根據(jù)惡性 瘧原蟲海南株全長TCTP基因序列、pMD一踢一T克隆載體限制性酶切位點及 pQE一30表達載體限制性酶切位點設(shè)計引物，以含有TcTP基因的陽性單克隆 噬菌體入DNA為模板，擴增惡性瘧原蟲海南株全長‘lC’l’P基因，經(jīng)與pMD一18一T 克隆載體重組，轉(zhuǎn)化XLI一Blue。提取pMD一18一T質(zhì)粒測序并登陸美國GenBank 國際基因庫檢索，所克隆的惡性瘧原蟲海南株fCTP基因與基因庫中的惡性瘧 原蟲TCTP基因序列完全一致，提示己止確克隆了惡性瘧原蟲海南株TCTP基 因。對重組pMD一18一T克隆載體及pQE一30表達載體雙酶切，提取TCTP基因和 pQE一30空載體并使二者重組，然后轉(zhuǎn)化M15，挑取陽
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍軍需大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：Q781
【部分圖文】：

oPCR產(chǎn)物經(jīng)玻璃奶試劑盒
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本文編號：2857118