Rv2742是本課題組前期基于蛋白質(zhì)基因組學(xué)策略從結(jié)核分枝桿菌Mycobacteriumtuberculosis H37Rv中發(fā)現(xiàn)、鑒定的遺漏注釋基因。文中旨在建立結(jié)核分枝桿菌H37Rv漏注釋蛋白R(shí)v2742的可溶性誘導(dǎo)表達(dá)、純化體系,為進(jìn)一步探索Rv2742基因參與的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的pGEX-4T-2-Rv2742、pET-28a-Rv2742、pET-32a-Rv2742及pMAL-c2X-Rv2742原核表達(dá)載體均無法實(shí)現(xiàn)目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。但經(jīng)密碼子優(yōu)化后,僅有pMAL-c2X-Rv2742載體能夠?qū)崿F(xiàn)目的蛋白的可溶性誘導(dǎo)表達(dá)。此外,通過比較不同宿主菌、溫度及IPTG濃度對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響,發(fā)現(xiàn)目的蛋白在Rosetta (DE3)中,16℃及0.5mmol/LIPTG誘導(dǎo)條件下表達(dá)量最高。直鏈淀粉樹脂(Amyloseresin)親和層析柱純化獲得較純的產(chǎn)物,經(jīng)LC-MS/MS驗(yàn)證確認(rèn)是Rv2742融合蛋白肽段序列。成功獲得結(jié)核分枝桿菌H37Rv新基因Rv2742的重組蛋白,可進(jìn)一步開展其潛在相互作用及免疫原性研究工作。
【部分圖文】：

壞闋⑹痛砦螅?可變剪接；核糖體移位；漏注釋等)，給準(zhǔn)確解析相應(yīng)物種的生物學(xué)機(jī)制帶來了困擾[18]。利用蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，結(jié)合基因組數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來研究基因組注釋問題，被稱為蛋白質(zhì)基因組學(xué)(Proteogenomics)[19]。近10年來，蛋白質(zhì)組學(xué)直接用于基因組的注釋已經(jīng)越來越受到相關(guān)領(lǐng)域的關(guān)注。本課題組前期基于深度覆蓋的精準(zhǔn)蛋白質(zhì)基因組學(xué)技術(shù)[20,24]和比較基因組學(xué)策略，完成了H37Rv基因組數(shù)據(jù)庫的重注釋，發(fā)現(xiàn)了22個(gè)結(jié)核遺漏注釋基因，矯正了28個(gè)N端注釋錯(cuò)誤基因(圖1，尚未發(fā)表)。此發(fā)現(xiàn)有利于結(jié)核新型特異性免疫原性分子標(biāo)志物篩選，為結(jié)核病的快速、精準(zhǔn)臨床檢測(cè)提供基礎(chǔ)理論和原始創(chuàng)新技術(shù)支持。從TubercuList庫中下載了H37Rv(http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/)基因組注釋數(shù)據(jù)庫，共4031個(gè)基因，包含4018個(gè)編碼基因和13個(gè)假基因。六閱讀框翻譯數(shù)據(jù)庫由中國科學(xué)院計(jì)算技術(shù)研究所pFind團(tuán)隊(duì)與我們課題組合作開發(fā)的蛋白質(zhì)基因組學(xué)軟件pAnno對(duì)NCBI中結(jié)核分枝桿菌H37Rv的基因組文件(NC000962.3.fna)按照正鏈和互補(bǔ)鏈上連續(xù)的3個(gè)核苷酸翻譯一個(gè)圖1結(jié)核分枝桿菌H37Rv蛋白質(zhì)基因組學(xué)分析流程圖Fig.1WorkflowofMycobacteriumtuberculosisH37Rvproteogenomicanalysis.氨基酸的規(guī)則翻譯，使用終止子到終止子的翻譯模式，采用MTB特殊的3種起始密碼子ATG、GTG和TTG，共翻譯得到141851個(gè)開放閱讀框(Openingreadingframe，ORF)。與已注釋的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行合并，經(jīng)過嚴(yán)格FDR篩選，結(jié)合譜圖人工核實(shí)、肽段合成驗(yàn)證、轉(zhuǎn)錄豐度、基因組多序列比對(duì)，獲得了一批質(zhì)量可信

?H37Rv新基因Rv2742克隆表達(dá)及純化：010-64807509：cjb@im.ac.cn1777約420bp，與預(yù)期的目的片段大小一致(圖2A)，表明成功獲得目的基因Rv2742。純化的Rv2742目的片段與pMD18-T連接轉(zhuǎn)化后進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，在目的條帶處成功獲得特異性條帶(圖2B)，且測(cè)序序列正確。EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切pMD18T-Rv2742質(zhì)粒6h，酶切片段約為420bp，與預(yù)期大小相符(圖2C)。EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切質(zhì)粒pMAL-c2X，酶切片段約為6478bp(圖2D)，與預(yù)期相符。將雙酶切后回收的目的片段與載體片段連接轉(zhuǎn)化進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，在目的條帶處獲得特異性條帶(圖2E)，說明成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c2X-Rv2742-2。2.2四種表達(dá)載體均未實(shí)現(xiàn)Rv2742目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)經(jīng)Glycine-SDS-PAGE或Tricine-SDS-PAGE[26]電泳結(jié)果分析，如圖3A所示，發(fā)現(xiàn)在28℃1mmol/LIPTG誘導(dǎo)6h后，pGEX-4T-2系統(tǒng)表達(dá)的Rv2742目的融合蛋白(分子量為40.85kDa)主要分布在沉淀中，但在誘導(dǎo)后上清中并沒有明顯的新增條帶，說明以pGEX-4T-2系統(tǒng)表達(dá)的Rv2742目的融合蛋白主要以包涵體形式存在。如圖3B、3C、3D所示，分別以pET-32a、pET-28a、pMAL-c2X系統(tǒng)表達(dá)的Rv2742目的融合蛋白(分子量分別為28.16、18.04、56kDa)在誘導(dǎo)后上清與沉淀中均未出現(xiàn)明顯的新增特異性條帶，說明以pET-32a、pET-28a以及pMAL-c2X表達(dá)的Rv2742目的融合蛋白均未能成功實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)。綜上所述，以H37Rv基因組DNA克隆的Rv2742基因序列為模板所構(gòu)建的pGEX-4T-2-Rv2742

趙加玲等/結(jié)核分枝桿菌H37Rv新基因Rv2742克隆表達(dá)及純化：010-64807509：cjb@im.ac.cn1783圖8IPTG誘導(dǎo)表達(dá)Rv2742蛋白生長曲線的測(cè)定Fig.8DeterminationofgrowthcurveofexpressionofRv2742fusionproteininducedby0.5mmol/LIPTG.3討論大腸桿菌是一種基因組G+C含量低(<50%)的革蘭氏陰性菌，而結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)是一種基因組G+C含量高(>65%)的革蘭氏陽性放線菌[28]，放線菌基因組的典型特征就是基因組G+C含量高。結(jié)核分枝桿菌G_和C_結(jié)尾末端的密碼子具有很強(qiáng)的偏倚性，第3個(gè)位點(diǎn)的密碼子(G+C)含量高達(dá)83%[29]。密碼子偏倚性影響翻譯過程中氨基酸插入的準(zhǔn)確性、多肽折疊和mRNA序列的穩(wěn)定性等幾方面[30]。結(jié)核分枝桿菌目的基因在大腸桿菌中不易表達(dá)可能主要是由于G+C含量高和獨(dú)特密碼子的使用[31]。生物體中基因所使用的密碼子和tRNA的豐度有著強(qiáng)的正相關(guān)性。依照物種的偏好性對(duì)mRNA的序列進(jìn)行優(yōu)化，將目的基因的密碼子替換成宿主細(xì)胞常用的密碼子，能夠增加tRNA的結(jié)合效率從而提高蛋白質(zhì)表達(dá)水平。本次實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)核新基因Rv2742編碼蛋白分子量本身不大，pET-32a和pET-28a雖然同屬pET載體，標(biāo)簽大小對(duì)小蛋白的表達(dá)有一定程度的影響，所以在實(shí)驗(yàn)過程中考慮到使用不同種類和大小標(biāo)簽的pET載體。但僅在密碼子優(yōu)化后，利用pMAL-c2X原核表達(dá)系統(tǒng)才在上清和沉淀中都實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，沉淀中表達(dá)含量要比可溶性部分高。后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)一步考慮對(duì)以包涵體形式表達(dá)的蛋白進(jìn)行變性和復(fù)性。誘導(dǎo)后上清雖然實(shí)現(xiàn)了可溶性誘導(dǎo)表達(dá)，但表達(dá)含量較低，可從溫度、IPTG濃度、抗生素濃度
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2852836