一、RGD肽與尿激酶B鏈融合蛋白表達載體的構(gòu)建、表達及生物活性的初步分析 將化學(xué)合成的RGD肽編碼寡核苷酸與尿激酶B鏈cDNA相連成為融合基因后克隆至原核表達質(zhì)粒pBV220中,在P_RP_I啟動子的作用下經(jīng)42℃熱誘導(dǎo)在大腸桿菌DH5α中獲得了融合基因的表達,其表達量占菌體總蛋白的9.2%,表達產(chǎn)物以無活性的包含體形式存在。經(jīng)變復(fù)性處理得到分離的融合基因的表達產(chǎn)物,經(jīng)western blotting分析表明產(chǎn)物具有與天然尿激酶相似的抗原性,其體外活性分析顯示具有一定的纖溶和抗血小板聚集的活性。 二、尿激酶氨基末端基因轉(zhuǎn)染抗腫瘤轉(zhuǎn)移的實驗研究 為探討尿激酶氨基末端片段(ATF)基因轉(zhuǎn)移對腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響,將ATF基因克隆并重組入真核表達載體pcDNA3,得pcDNA3-ATF;用脂質(zhì)體Lipofectin介導(dǎo)將pcDNA3-ATF導(dǎo)入uPA和uPAR均有表達的人高轉(zhuǎn)移性肺癌PG細(xì)胞系和人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系。用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞ATF基因的表達;觀察ATF基因轉(zhuǎn)移對腫瘤細(xì)胞體外侵襲人工基底膜能力的影響;經(jīng)裸鼠皮下接種腫瘤細(xì)胞復(fù)制自發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移模型,觀察轉(zhuǎn)ATF基因細(xì)胞成瘤性和轉(zhuǎn)移性的改變。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染ATF基因后,腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)ATF基因的明顯表達;體外侵襲穿透人工基底膜的能力明顯減弱;體內(nèi)接種實驗表明,原位成瘤性不受影響,但自發(fā)性轉(zhuǎn)移能力下降。上述結(jié)果揭示ATF基因轉(zhuǎn)染后的腫瘤細(xì)胞通過ATF基因的表達與尿激酶競爭其受體的結(jié)合可在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞的惡性表型。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：1999
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

分子量標(biāo)準(zhǔn)21uPAB鏈PCR(R)uB擴增結(jié)果o一RuB和pBv220一uB的構(gòu)建膚的寡核昔酸正、反義鏈退火及經(jīng)EcoRI和Pstl雙酶切表達質(zhì)粒pBV220一RuB(圖l酶切后與經(jīng)EcoRI和Psrll后平端連接，構(gòu)建成B鏈的DH5a，挑取若干轉(zhuǎn)化子培，pBv22o一RuB陽性重組子用片段，pBV22o一uB陽性重組，圖s和圖6分別為pBV22過DNA重組構(gòu)建了原核表

酶切鑒定

pBV22O一RuB測序結(jié)果
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 宋安,劉建寧,余瑞榮,崔大敷,周同明,崔恒苒,朱德煦;尿激酶對纖維蛋白低親和性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)——Ⅱ.尿激酶A鏈149—157片段對纖維蛋白促進tPA激活纖溶酶原的抑制作用[J];中國科學(xué)(B輯 化學(xué) 生命科學(xué) 地學(xué));1991年11期

2 劉士輝,黃培堂,黃翠芬;組織型纖溶酶原激活劑突變體的構(gòu)建、表達及特性分析[J];中國科學(xué)(B輯 化學(xué) 生命科學(xué) 地學(xué));1995年04期

3 趙慶國,黃培堂,劉士輝;人組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)組合突變體FrGGl在CHO細(xì)胞中的高效表達[J];生物工程學(xué)報;1997年01期

本文編號：2854413