人類基因組計劃將基因組學(xué)推向了生物醫(yī)學(xué)研究的最前沿。基因組學(xué)研究的進(jìn)展又將由之產(chǎn)生的新的生物技術(shù)推向了世界經(jīng)濟(jì)的前沿。在這個時代，基因組藥物具有巨大的開發(fā)潛力。迄今為止至少有19個腫瘤壞死因子(TNF)超家族和29個腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員被發(fā)現(xiàn)，它們作為機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的一類重要的細(xì)胞因子，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及免疫反應(yīng)、炎癥等一系列生理和病理反應(yīng)過程中均具有非常重要的調(diào)控作用。 TALL-1(TNF and apoptosis ligand-related leukocyte-expressed ligand 1)又名BlyS、THANK、BAFF、zTNF4和TNFSF20，是1999年首次克隆成功的屬于TNFSF一個新成員，在外周血單核細(xì)胞、淋巴結(jié)、脾臟和骨髓等組織中表達(dá)最豐富。人TALL-1基因全長編碼285個氨基酸，是一個典型的Ⅱ型穿膜蛋白，其中部分胞外區(qū)片段(A134～L285)在某些蛋白酶的作用下發(fā)生水解，可形成可溶性功能片段(sTALL-1)。與TNF家族其它成員相比，TALL-1胞外區(qū)與APRIL有高度的同源性，而與其它家族成員如TNF、FasL、LT、TRAIL、LTα、LIGHT及RANKL等的同源性則小于20％。目前證實B細(xì)胞成熟蛋白(B cell maturation protein,BCMA)、跨膜激活與CAML作用因子(transmembraneactivator and CAML-interactor,TACI)和B細(xì)胞激活因子受體(BAFF-R)是TALL-1的受體。TALL-l是一個多功能多效應(yīng)分子，具有強(qiáng)大的免疫調(diào)控功能，首先作為B淋巴細(xì)胞生長的強(qiáng)共刺激因子，TALL-1廣泛參與調(diào)節(jié)B細(xì)胞的發(fā)育和分化以及抗體的產(chǎn)生；而且還廣泛參與T細(xì)胞的活化和應(yīng)答過程；其次TALL-1還具有TNF超家族成員的共性，對多種腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒效應(yīng)。TALL-1除了在生理條件下參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)以外，還與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，在轉(zhuǎn)基因動物試驗中人們發(fā)現(xiàn)TALL-1在狼瘡樣等自身免疫性疾病形成中很可能具有重要的調(diào)控功能，其過量表達(dá)可明顯提高機(jī)體的成熟B細(xì)胞及外周CD4+和CD8+T細(xì)胞的數(shù)目，從而誘發(fā)一系列自身免疫性疾病。 鑒于TALL-1的重要作用，自發(fā)現(xiàn)以來很快成為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。為了探討TALL-1的生物學(xué)性能及用于自身免疫性疾病和腫瘤治療的免疫調(diào)節(jié)的可能性，以及深入的研究結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，開發(fā)新型基因組藥物打下基礎(chǔ)，本研究首先通過生物信 第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 息學(xué)分析設(shè)計合成引物，采用RT一PCR技術(shù)從人新鮮淋巴結(jié)組織中獲得編碼TALL一l基 因全長及其可溶性部分的基因編碼區(qū)cDNA;隨后構(gòu)建了攜帶TALL一1基因全長及其可 溶性部分基因編碼區(qū)cDNA的畢赤酵母分泌型表達(dá)質(zhì)粒和原核表達(dá)質(zhì)粒，在此基礎(chǔ)上篩 選獲得含多拷貝基因的高表達(dá)株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，親和層析純化獲得了重組sTALL一1蛋 白;在細(xì)胞水平及分子水平初步進(jìn)行sTALL一1的功能研究，觀察sTALL一1刺激B淋巴 細(xì)胞增殖活性及對純化人外周T淋巴細(xì)胞的共刺激效應(yīng)，初步研究sTALL一1蛋白對腫 瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)及其機(jī)理;最后利用己知的晶體結(jié)構(gòu)信息和生物信息學(xué)分析對 sTALL一1結(jié)構(gòu)進(jìn)行了缺失突變，得到了兩個突變體，并對它們進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)和初步鑒 定。研究的主要實驗方法及結(jié)果如下: 1、通過生物信息學(xué)分析設(shè)計合成引物，采用RT一PCR技術(shù)從人新鮮淋巴結(jié)組織中 克隆獲得編碼TALL一1基因全長及其可溶性部分的基因編碼區(qū)cDNA，將其克隆入有。 因子分泌信號膚的畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPIC一gK中，并進(jìn)行了序列測定。 2、將表達(dá)載體采用單交換的整合方式電轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株GS 1 15(Mut+)，篩選高 拷貝重組轉(zhuǎn)化子，通過對甲醇誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化，表達(dá)量有所提高但仍然不夠理想， SDS一PAGE分析未見明顯的目的蛋白條帶，分泌上清中總蛋白含量測定在d4一d5達(dá)到高 峰，采用RT~PCR和3’RACE方法從轉(zhuǎn)錄水平檢測到轉(zhuǎn)化子中目的基因的轉(zhuǎn)錄，W七stem blot和EUSA檢測結(jié)果顯示，濃縮后的表達(dá)上清中確實含有目的蛋白，上述結(jié)果證實了 目的基因在P.pastoris畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)中分泌表達(dá)的可行性，并且表達(dá)產(chǎn)物具有 免疫反應(yīng)活性和抗原性，同時由于采用的是具有中和活性的單抗，二者發(fā)生反應(yīng)一定程 度上說明分泌上清中的目的蛋白具有hTALL一1的生物活性，在此基礎(chǔ)上利用MTT方法 檢測到分泌上清的濃縮凍干產(chǎn)物對Hela細(xì)胞的生長有抑制效應(yīng)，進(jìn)一步證實分泌上清 中的目的蛋白具有hTALL一1的生物學(xué)活性。 3、將目的基因亞克隆到pGEx一4T一1質(zhì)粒，測序證實后轉(zhuǎn)染BLZI大腸桿菌，篩選 獲得含多拷貝基因的高表達(dá)株，以護(hù)TG誘導(dǎo)其高效表達(dá)，優(yōu)化表達(dá)條件，初步探索 sTALL一1基因工程表達(dá)的條件，建立sTALL一1原核表達(dá)基因工程菌株，并用禍聯(lián)有谷朧 甘膚的GsTrap親和層析純化，凝血酶柱上切割獲得sTALL一1蛋白，SDS一 PAGE和Westem blot檢測純化蛋白。 4、在細(xì)胞和分子水平初步進(jìn)行sTALL一1的功能研究，結(jié)果表明表達(dá)蛋白sTALL一l 與抗IgM共同刺激B淋巴細(xì)胞，可使B淋巴細(xì)胞達(dá)到不同程度的增殖:在抗CD3單抗 第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 作用的基礎(chǔ)上，加用表達(dá)蛋白sTALL一1可明顯增強(qiáng)抗CD3單抗對T淋巴細(xì)胞的刺激作 用;應(yīng)用MTTt匕色法發(fā)現(xiàn)，表達(dá)產(chǎn)物sTALL一l蛋白對A549、Hela、H446和U937細(xì) 胞具有明顯的生長抑制效應(yīng)，凋亡率從41.4%勺2.5%
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

明所提取的RNA純度較高，符合實驗要求。甲醛瓊脂糖變性電泳結(jié)果顯示:具有285、185和5s三條帶，且285:185大約為2:1，確定RNA的完整性較好，沒有發(fā)生降解，所得RNA符合RT.PCR模板要求(圖3)。Fig3AgaroseeleetrOPhoresisanalysisoftotalRNA

取純度和完整性均較好的總RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄及高保真Taq酶PCR擴(kuò)增后，取擴(kuò)增產(chǎn)物spl電泳，可以觀察到特異性擴(kuò)增帶，位置分別相當(dāng)于858bp和459bp，與預(yù)期的大小完全一致(見圖4)。圖4基因片段的RT一CR結(jié)果Flg4Rl，一PCRresultsofgenesegments3.酵母表達(dá)載體pP1CgK一hTALL一1和pP1CgK一sTALL一1的構(gòu)建和鑒定3.1PCR鑒定和酶切鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，在T4DNA連接酶作用下，與pPIcgK載體連接構(gòu)建重組子，對連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR鑒定、酶切鑒定，鑒定結(jié)果進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳(圖5，6)，結(jié)果表明目的基因重組到表達(dá)載體上，分別命名為pPIcgK一hTALL一1和PpICgK一sTALL一l。3.2DNA序列分析登陸http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAsT/采用Aligntwosequences(blZseq)與公布的TALL一IcDNA序列(GenBank登錄號AF1326OO)同源性比對分析

圖5pplcgK一hTALL.l和ppICgK一sTALL一1重組載體的酶切鑒定Fig5RestrietionenzyrnedigestionanalysisofPPICgK一hTALL~】andPPICgK一sTALL一lM12Marker:DL2000(20創(chuàng)刃100叨750/500/250/100bP):STALL一12:hTALL.1
【參考文獻(xiàn)】

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3 蔣嵐,楊永華,龔毅,楊勝利;稀有密碼子對proUK基因在大腸桿菌中高表達(dá)的影響[J];生物工程學(xué)報;1999年01期

本文編號：2849358