G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）是一類重要的細胞表面受體。GPCR的細胞內信號主要由G蛋白介導。激動劑的持續(xù)存在能引起GPCR的失敏，而激動劑誘導的GPCR磷酸化和內吞等是GPCR介導信號的負調控的主要機制。G蛋白偶聯(lián)受體激酶 (GRK)是催化激動劑誘導的GPCR磷酸化以及啟動GPCR脫敏的關鍵激酶。已發(fā)現(xiàn)七種GRK（GRK1-7），其中GRK2和GRK3主要分布在細胞漿，GRK的功能受GPCR和G蛋白等多種因素的嚴格調控。已知GRK2和GRK3只有與G蛋白((亞單位結合后才能向細胞膜轉位，而且GRK只有與激活的GPCR結合以后，才能被激活并產生催化活性�，F(xiàn)有的GRK功能調控假說認為：激動劑激活GPCR后導致游離的G((二聚體釋放，隨后GRK與錨定在細胞膜上的G((亞單位結合使GRK轉位至細胞膜并磷酸化GPCR。但這一假說尚未得到體內實驗證實，GRK向細胞膜轉位和催化受體磷酸化的具體機制也不清楚。本研究在人胚胎腎細胞系（HEK293）中以(-阿片受體（DOR）為模型探討了GPCR對GRK功能的調控機制，主要研究了激動劑誘導的GRK與G蛋白偶聯(lián)受體和GRK與G((的相互作用及其對GRK細胞膜轉位和GRK功能的影響。 本研究結果表明：（1）激動劑激活野生型DOR能誘導GRK2和受體的結合，使GRK2由細胞漿轉位至細胞膜并催化DOR發(fā)生磷酸化。而在表達DOR羧基末端缺失突變體(31（不含有GRK磷酸化位點）的細胞中，激動劑的刺激不僅不能引起受體發(fā)生磷酸化，也不能誘導GRK2和受體的結合以及GRK2向細胞膜轉位。這一結果證明，DOR的羧基末端是決定GRK2與受體結合的關鍵區(qū)域，并提示GPCR與GRK的結合是激動劑誘導GRK向細胞膜轉位的必要條件。（2）進一步的實驗結果顯示，將DOR羧基末端GRK磷酸化位點鄰近的酸性氨基酸突變?yōu)橹行园被?E355Q/D364N)后，激動劑刺激不能誘導其與GRK2的結合，并且也不能引起GRK2向細胞膜轉位及使受體發(fā)生磷酸化。而所有三個GRK磷酸化位點都突變的DOR（M3）盡管不能發(fā)生磷酸化，但在激動劑刺激后能夠與GRK2結合，并誘導GRK2向細胞膜轉位。這些結果證明DOR的GRK磷酸化位點在GRK2與受體結合中不起重要作用，而其鄰近的酸性氨基酸殘基是受體結合GRK的關鍵位點。（3）實驗結果顯示，在激動劑刺激后，受體免疫復合物中不僅含有GRK，而且可檢測出G(。G((亞基在受體復合體中的存在取決于受體與GRK的相互作用。共表達G((亞單位能促進激動劑誘導的GRK2和受體的結合以及GRK2向細胞膜轉位。而共表達能夠競爭結合G((亞單位的G(t或GRK2羧基末端能夠完全抑制激動劑誘導的受體和GRK2的結合以及GRK2向細胞膜轉位。這些結果證明激動劑刺激能誘導DOR-GRK2-G((復合體形成，并且這種復合體的形成是激動劑誘導的GRK2向細胞膜轉位及GRK發(fā)揮功能的一個關鍵環(huán)節(jié)。 WP=5 上述研究結果表明，G蛋白偶聯(lián)受體不僅僅是GRK的底物，而且還是調控GRK功能的一個重要的因素。激動劑誘導的GPCR與GRK的結合是GRK向細胞膜轉位的必要條件之一；激動劑能夠誘導GPCR、GRK、G((在細胞膜上形成復合體，這種GPCR-GRK-G((復合體的形成是GRK向細胞膜轉位及發(fā)揮催化功能的必要條件。
【學位單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2003
【中圖分類】：Q51
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
前言
材料和方法
實驗結果
討論
參考文獻
致謝
附錄
    綜述
    發(fā)表論文及獲獎情況

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