RNA是在基因表達層面探究分子生物學(xué)機制的重要研究對象.由于RNA化學(xué)性質(zhì)活潑、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,并且內(nèi)外源RNA酶無處不在,如何從環(huán)境流行病學(xué)研究收集到的全血樣本中提取出高質(zhì)量的總RNA是困擾研究人員的一大難題.本研究旨在建立一種能長期保存全血樣本并從中提取出高質(zhì)量總RNA的方法.通過將環(huán)境流行病學(xué)研究中采集到的少量新鮮全血立即與10倍體積的TRIzol試劑混勻后置于-80℃冰箱中,可保護RNA在長期保存過程中不發(fā)生降解.針對長期保存的全血-TRIzol混合體系,在經(jīng)典的TRIzol一步法基礎(chǔ)上,無需將全血樣本分裝至不含RNA酶的1.5 mL離心管,直接在較大操作空間(不含RNA酶的15 mL離心管)中進行總RNA相分離、沉淀、洗滌等操作,并在總RNA晾干前再增加離心并吸取少量殘留液體操作,縮短自然晾干時間.本方法無需離心、分離血漿、裂解紅細胞等繁雜的前處理步驟,極大地簡化了操作步驟,減少了采樣工作量,實現(xiàn)了對全血樣本的低成本長期保存.通過增大操作空間、改進晾干操作,本方法顯著提高了總RNA樣本的完整性和純度.使用本方法提取出保存一年的全血總RNA產(chǎn)率為(9.18±2.10)μg·mL~(-1),完整性指標RIN值和28S/18S分別為8.98±0.18和1.08±0.08,純度指標OD_(260)/OD_(280)和OD_(260)/OD_(230)分別為2.18±0.04和1.70±0.00.保存兩年的全血提取出總RNA的產(chǎn)率、完整性及純度仍然可以滿足下游實驗要求.
【部分圖文】：

表2 總RNA產(chǎn)率、完整性及純度指標Table 2 The yield, integrity and purity of total RNA 組別 RNA產(chǎn)率/(μg·mL-1) RNA完整性 RNA純度 RIN值 28S/18S OD260/OD230 OD260/OD280 A組 9.18±2.10 8.98±0.18 1.08±0.08 2.18±0.04 1.70±0.00 B組 9.14±2.52 8.46±0.21* 1.00±0.10 2.10±0.07 1.88±0.04** C組 4.86±1.03* 7.78±0.33** 0.92±0.15 0.76±0.22** 1.90±0.00NA D組 7.78±2.57 3.76±1.43** 0.28±0.15** 0.66±0.17** 1.94±0.05** 注:與A組相比,*p<0.01,**p<0.001,T檢驗.圖2 Agilent 2100生物分析儀中總RNA電泳圖譜

圖1 Agilent 2100生物分析儀中總RNA凝膠樣圖譜表2中A組總RNA產(chǎn)率為(9.18±2.10) μg·mL-1,即從保存一年的0.5 mL全血中提取出約4.6 μg總RNA,滿足下游分析對RNA總量的要求.A組樣本的完整性指標RIN值和28S/18S分別為8.98±0.18和1.08±0.08.RIN值較高,滿足高通量測序RIN值大于7.0的要求.28S/18S均值大于1.0,但相對偏低,與理論值相差較大,說明樣品完整性受到一定影響.但綜合RIN值和28S/18S兩項指標,說明全血按本方法保存一年后提取出的總RNA完整性較好.圖1顯示A組樣本凝膠樣圖譜中28S和18S條帶清晰,圖2中A組樣本電泳圖譜基線平整,沒有降解雜峰,28S和18S的峰形清晰且突出.A組樣本的OD260/OD230和OD260/OD280分別為2.18±0.04和1.70±0.00,表明本方法提取出的總RNA純度較高.總的來說,全血按本方法保存一年后提取出的總RNA產(chǎn)率高,完整性較好且純度較高,滿足下游分析對RNA的質(zhì)量要求.
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