丙型肝炎病毒(HCV)屬黃病毒科，可以引起急慢性肝炎、肝硬化及肝癌，目前世界上有1.7億人感染，治療上只有干擾素和利巴韋林，但是療效有限。此病毒表達十種蛋白，C、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b，在病毒的復(fù)制中各有不同的功能，但有些具體功能還不清楚。HCV的致病機制及對免疫的調(diào)節(jié)可能與病毒蛋白對肝細胞或淋巴細胞的作用有關(guān)，為了研究病毒蛋白質(zhì)對肝細胞的作用，利用九十年代初出現(xiàn)的酵母雙雜交技術(shù)，進行了文庫篩選，以期篩選出與病毒蛋白相互作用蛋白基因。 根據(jù)全長HCV-H cDNA，我們設(shè)計了HCV核心蛋白基因(HCV-H株的342-914nt)、NS2基因(2769-3419nt)、NS3基因(3420-5312nt)的引物，進行擴增，連接到pGEM-T載體中測序證實后，酶切連接到酵母雙雜交“餌”載體pGBKT7中，轉(zhuǎn)化AH109(a型)酵母株，轉(zhuǎn)化成功后，表達各自蛋白，用Western blotting確定蛋白表達。把轉(zhuǎn)化好的AH109酵母菌，與含有肝cDNA文庫的酵母菌Y187(α型)進行配合，在鋪有x-α-gal 內(nèi)’削子擬芮。毒蛋白用互作口蛋臼基囚禿隆化及HCbp6功能研究－2－第三貝共1刀 貞 的三缺、四缺培養(yǎng)基上進行篩選。提取蘭色酵母菌落的質(zhì)粒，測 序進行生物信息學(xué)分析。所獲得的未知功能基因存入 GenBank「AY032593（HcBPI）、AY032594（HcBP6）、AF395068（。BP12）、 AF43595（NS3BP）」，感興趣的己知與未知基因進行確定性的再次 酵母雙雜交實驗，及體外免疫共沉淀實驗以證實真正的相互作 用。 發(fā)現(xiàn)HCV核心 蛋白可以與HU HCbPI，HC HCbp6，HU HCbplZ 以及Translin蛋白相互作用，Translin是轉(zhuǎn)位蛋白，在淋巴瘤 發(fā)病中起重要作用，HCV感染病人的淋巴瘤發(fā)病率明顯高于正常 人，所以HCV核心蛋白與轉(zhuǎn)位蛋白的相互作用，可能是其發(fā)病的 部分原因。 為研究 HU HCBP6 蛋白的功能，我們把它的基因連接到 PEGF＊CI中，轉(zhuǎn)化HePGZ、NIH 3T3、COS－7細胞系，在熒光顯 微鏡下定位，發(fā)現(xiàn)此蛋白質(zhì)定位在細胞器中。在此過程中發(fā)現(xiàn)此 蛋白質(zhì)具有刺激細胞生長作用，為了進一步確定是否有促進細胞 生長作用，對其進行了MTT代謝實驗，發(fā)現(xiàn)代謝明顯高于正常， 說明具有明顯的促進細胞生長作用。 為了進一步研究其有無致瘤性我們正在進行這方面的研究。 HU HCbP12蛋白質(zhì)的功能還不清楚。 這些未知蛋白基因的克隆成功，為今后HCV的致病機理的研 究提供了線索，特別是HU HCbp6具有促進細胞生長作用，可能 與肝癌的發(fā)生有關(guān)，HCV核心蛋白與轉(zhuǎn)位蛋白的相互作用與淋巴 瘤和肝細胞癌的發(fā)生有關(guān)。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2002
【中圖分類】：R373.21
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
前言
主要儀器設(shè)備
英文縮略詞
第一部分 HCV各基因的酵母雙雜交“餌”載體的構(gòu)建與表達
    引言
    第一節(jié) HCV核心蛋白酵母雙雜交“餌”載體的構(gòu)建與酵母中表達
    第二節(jié) HCVNS2酵母雙雜交“餌”載體的構(gòu)建與酵母中表達
    第三節(jié) HCVNS3酵母雙雜交“餌”載體的構(gòu)建與酵母中表達
    討論
第二部分 酵母雙雜交篩選
    引言
    第一節(jié) 酵母雙雜交篩選與HCV核心蛋白相互作用蛋白基因
    第二節(jié) 酵母雙雜交篩選與HCVNS3相互作用蛋白基因
第三部分 體外免疫共沉淀實驗
    引言
    第一節(jié) 未知基因及感興趣已知基因的克隆化
    第二節(jié) 體外表達
    第三節(jié) 體外免疫共沉淀
    討論
第四部分 Hcbp6基因功能研究
    引言
    第一節(jié) Hcbp6在細胞內(nèi)定位
    第二節(jié) Hcbp6對細胞生長的研究
    第三節(jié) Hcbp6蛋白質(zhì)對HCV核心蛋白反式激活的影響
    討論
總結(jié)
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的文章
文獻綜述一
文獻綜述二
致謝

【引證文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 何曉瑜;HCBP6基因過表達載體和RNAi載體的構(gòu)建及其功能學(xué)研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2011年

本文編號：2845569