背景 近年來,干細(xì)胞因其作為生物醫(yī)學(xué)組織工程技術(shù)和治療性克隆技術(shù)的種子細(xì)胞,為實(shí)現(xiàn)人類健康長(zhǎng)壽的夢(mèng)想帶來了新的希望,而成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。根據(jù)干細(xì)胞的分化階段,分為胚胎干細(xì)胞(embryo stem cells,ESCs)和成體干細(xì)胞(adult stem cells,ASCs)。目前異體來源的ESCs在臨床應(yīng)用上還需要攻克細(xì)胞分化機(jī)制、免疫排斥等問題,而治療性克隆獲得的ESCs雖可以解決免疫排斥問題,但其技術(shù)復(fù)雜、離分化完全的功能細(xì)胞距離較遠(yuǎn)。ASCs存在于成體組織中,具有來源豐富、可塑性強(qiáng)、離成熟細(xì)胞近和多向分化潛能等特點(diǎn),而且可以實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療,無免疫排斥問題,因此是最具有臨床應(yīng)用優(yōu)勢(shì)的種子細(xì)胞。目前已在成人骨髓、軟骨、牙髓、血液、神經(jīng)、肌肉、脂肪、皮膚、角膜緣、肝臟、胰島等多種成體組織中發(fā)現(xiàn)了干細(xì)胞。現(xiàn)已證實(shí)成體干細(xì)胞有多向分化潛能,還可以橫向分化為不同類型的特化細(xì)胞甚至發(fā)生逆分化為更原始的干細(xì)胞。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow mesenchymal stem cells,MMSCs)作為ASCs中最易獲得的細(xì)胞,具有向多種中胚層和神經(jīng)外胚層甚至內(nèi)胚層來源的組織細(xì)胞分化的能力,這些細(xì)胞包括肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等。大量研究顯示MMSCs或者造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSCs)可在人為誘發(fā)肝臟病變后實(shí)驗(yàn)鼠體內(nèi)分化為肝細(xì)胞,重建肝臟,使病鼠肝臟功能恢復(fù)正常。同時(shí)多家研究者在體外利用小鼠骨髓細(xì)胞或來自骨髓的成體多潛能干細(xì)胞在不同條件下分化為類肝細(xì)胞。MSCs具有可反復(fù)多次采集和自體移植或應(yīng)用而不出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)。如果能夠利用易于獲得的MSCs在體外誘導(dǎo)分化為成熟肝細(xì)胞,將為肝細(xì)胞移植及生物人工肝提供大量的細(xì)胞來源。 中國(guó)肝病患者眾多,對(duì)肝硬化、肝壞死或遺傳性肝臟疾病的病變部位實(shí)行細(xì)胞替代或基因轉(zhuǎn)移治療是新發(fā)展起來并極有前景的肝臟病學(xué)治療策略。適合肝臟疾病細(xì)胞治療的供體細(xì)胞應(yīng)具有以下特點(diǎn):①易于獲得、培養(yǎng)、增殖,或建立細(xì)胞系;②能定向分化 國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863)資助項(xiàng)目(人肝細(xì)胞擴(kuò)增分化及人源化血細(xì)胞研究,No.2001AA216161) WP=18 為所需的肝細(xì)胞或膽管上皮細(xì)胞;③移植入體內(nèi)能長(zhǎng)期存活;④不誘導(dǎo)免疫排斥反應(yīng),對(duì)宿主無損害;⑤如果用于基因治療,目的基因可高效轉(zhuǎn)染供體細(xì)胞。MMSCs具備上述大部分條件,因此引起肝病研究者的高度關(guān)注。如果利用人自身骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞橫向分化為肝細(xì)胞則為肝臟疾病的細(xì)胞治療提供了另一個(gè)選擇。 雖然ASCs的研究已經(jīng)取得較大進(jìn)展,但在臨床上應(yīng)用還有許多問題,目前的多數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來自動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn),而且許多是群體細(xì)胞研究,并未在克隆細(xì)胞水平得到證實(shí)。人ASCs的特性是否與動(dòng)物一致,體外結(jié)果是否與體內(nèi)一致還不知道。更重要的是ASCs的分化潛能到底有多大及分化的分子機(jī)制還不十分清楚。ASCs在臨床上應(yīng)用還存在體外分離、擴(kuò)增、誘導(dǎo)及體內(nèi)移植后增殖調(diào)控等技術(shù)問題。MSCs體內(nèi)移植尚不能達(dá)到大規(guī)模增殖,體外向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化尚未見報(bào)道。ASCs的應(yīng)用研究剛剛起步,但現(xiàn)代生物技術(shù)在ASCs相關(guān)研究中的應(yīng)用必將加快其在臨床移植修復(fù)治療中的應(yīng)用進(jìn)程。 因此我們嘗試?yán)萌颂篗MSCs在體外向類肝細(xì)胞誘導(dǎo),觀察人胎兒MMSCs的特性,期望在成體干細(xì)胞橫向分化中作一些基礎(chǔ)研究工作。嘗試為臨床肝病治療中肝細(xì)胞來源提供新的可行性途徑。 目的 1. 建立人胎兒骨髓、臍帶血和肝臟間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的分離培養(yǎng)方法,觀察細(xì)胞生物學(xué)特性和細(xì)胞表型,獲得大量的人源性MSCs。 2. 人胎兒MMSCs體外向類肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化的條件建立及優(yōu)化。 3. 人胎兒MMSCs來源類肝細(xì)胞的分子生物學(xué)鑒定。 4. 人胎兒MMSCs來源類肝細(xì)胞的功能和超微結(jié)構(gòu)評(píng)估。 方法 1. 共收集12個(gè)人胎兒,平均孕周為18.5±4.6周,引產(chǎn)后4℃低溫保存。收集15份臍帶血。采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),分離培養(yǎng)人胎兒骨髓、臍帶血和肝非實(shí)質(zhì)細(xì)中MSCs,并研究其增殖及生長(zhǎng)特征。 2. 采用體外分離培養(yǎng)的MMSCs為研究對(duì)象,設(shè)計(jì)不同的誘導(dǎo)分化條件進(jìn)行體外誘導(dǎo),觀察細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中形態(tài)結(jié)構(gòu)變化及細(xì)胞生物學(xué)特性,應(yīng)用免疫組化檢測(cè)肝細(xì)胞標(biāo)志ALB和CK18的表達(dá),建立人胎兒MMSCs向類肝細(xì)胞分化的優(yōu)化條件。 3. 收集誘導(dǎo)培養(yǎng)第4d、7d、14d、21d、28d時(shí)的細(xì)胞爬片,SABC免疫組化法DAB顯色檢測(cè)肝細(xì)胞早期標(biāo)志AFP、CK19及早期轉(zhuǎn)錄因子GATA4,成熟肝細(xì)胞標(biāo)志ALB、CK18、GST-π、肝細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子HNF1α;提取誘導(dǎo)分化第10d和第28d細(xì)胞RNA及蛋白質(zhì),設(shè)計(jì)AFP、CK19、ALB、CK18、CYP1B1、CYP2B6引物,進(jìn)行RT-PCR,觀 WP=19 察在mRNA水平肝細(xì)胞標(biāo)志的表達(dá),采用Western-Blot檢測(cè)CK18、AFP、ALB的表達(dá)量。 4. 以未誘導(dǎo)的MMSCs作對(duì)照,對(duì)誘導(dǎo)4d、7d、14d、21d、28d MMSCs采用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中人白蛋白水平,脲酶法檢測(cè)合成尿素的能力,過碘酸希夫試驗(yàn)進(jìn)行糖原染色,電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果 1. 0.5～2h內(nèi)盡快分離骨髓,24h換液后可獲得約300±80個(gè)貼壁細(xì)胞,5個(gè)細(xì)胞以上的集落為15±6個(gè);培養(yǎng)細(xì)胞在種植后1～3d為生長(zhǎng)滯留期,第4d達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,以后進(jìn)入到平臺(tái)期,細(xì)胞分裂指數(shù)曲線的趨勢(shì)與生長(zhǎng)曲線基本類似,在達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,分裂相
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

圖 1-1-1 MMSCs 原代培養(yǎng) 40× Figure 1-1-1 MMSCs primary culture 40×圖 1-1-2 MMSCs 均等分裂 Figure 1-1-2 MMSCs equal division200× 600×

第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文圖 1-1-3 MMSCs 不均等分裂 600× Figure 1-1-3 MMSCs unequal division 600×

圖 1-1-5 MMSCs 生長(zhǎng)曲線 圖 1-1-6 MMSCs 分裂指數(shù)曲線Figure 1-1-5 MMSCs growth curve Figure 1-1-6 MMSCs divisional index curveP1 CD16692.1%P5 CD16693.6%P10 CD16693.4%P5 CD34P10 CD34P1 CD34
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王曉,李蔚,段芳齡;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多能性的研究進(jìn)展[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2003年01期

2 賈延劼,鐘樂,宋建輝,羅芳,孫吉平,楊于嘉;體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞(英文)[J];中國(guó)當(dāng)代兒科雜志;2003年05期

3 奚永志,唐佩弦;成體組織干細(xì)胞的“可塑性”或“橫向分化”特性遭受重大質(zhì)疑——成體組織干細(xì)胞真的具有“橫向分化”或“可塑性”潛能?[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2003年07期

4 尹雅玲,賀達(dá)仁,何群;成體干細(xì)胞可塑性研究中的若干哲學(xué)思考[J];醫(yī)學(xué)與哲學(xué);2004年09期

5 楊艷;汪維偉;;間充質(zhì)干細(xì)胞的可塑性研究現(xiàn)狀[J];國(guó)際移植與血液凈化雜志;2006年04期

6 鄭東;楊述華;馮勇;楊操;李進(jìn);梅榮成;唐欣;徐亮;;骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的單克隆化培養(yǎng)和多向分化的實(shí)驗(yàn)研究[J];實(shí)用骨科雜志;2007年05期

7 陸穎;王全立;王立生;吳祖澤;;脾結(jié)節(jié)形成細(xì)胞(CFU-S)向肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的分化[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2009年03期

8 ;前庭學(xué)[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)文摘.耳鼻咽喉科學(xué);1988年01期

9 魏麗華;崔海慶;王新成;李亞魯;;卵巢組織發(fā)生中間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察[J];泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1990年03期

10 嚴(yán)恒林，沈馨亞，劉才棟，陳麗璉，汪洋，王之美;培養(yǎng)純化的人胎兒許旺細(xì)胞在脫髓鞘大鼠脊髓內(nèi)的成活和遷移[J];中國(guó)神經(jīng)科學(xué)雜志;1995年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 何念海;人胎兒間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化為類肝細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

2 廖繼東;胎肝Sca-1～+細(xì)胞的橫向分化和應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)研究[D];暨南大學(xué);2004年

3 李中騫;人肺癌變啟動(dòng)研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1992年

4 王利;VIP對(duì)人造血干細(xì)胞增殖分化的影響及機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2004年

5 丁國(guó)斌;人胎兒表皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、基因轉(zhuǎn)染及向毛囊的定向分化[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2004年

6 崔慧斐;成體組織干細(xì)胞來源依據(jù)的研究[D];山東大學(xué);2003年

7 杜園園;結(jié)膜上皮細(xì)胞在角膜基質(zhì)中誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為角膜上皮樣細(xì)胞的研究[D];吉林大學(xué);2007年

8 陶克;人胎兒皮脂腺細(xì)胞和汗腺細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)和人胎兒表皮干細(xì)胞向毛囊、皮脂腺和汗腺誘導(dǎo)分化的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2005年

9 馬勇江;骨髓與脂肪間質(zhì)干細(xì)胞分離與誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2004年

10 李華川;人食管癌組織中多種抑癌基因的變化和亞硝胺對(duì)其作用的研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1993年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 趙豪;兔體外成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞橫向分化的初步研究[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2011年

2 王吉博;增強(qiáng)或減弱GJIC對(duì)兔脂肪細(xì)胞向成骨細(xì)胞橫向分化的影響[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2012年

3 李愛梅;大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)橫向分化為胰島素分泌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[D];東南大學(xué);2006年

4 楊海軍;間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其橫向誘導(dǎo)分化為角膜上皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[D];江西醫(yī)學(xué)院;2005年

5 柴淑芳;骨髓干細(xì)胞在睪丸中橫向分化可能性的探索[D];首都師范大學(xué);2007年

6 高強(qiáng);人胎兒肝干細(xì)胞—聚酸酐復(fù)合載體體外共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2008年

7 陸海華;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞肝內(nèi)移植治療肝功能損傷的實(shí)驗(yàn)研究[D];東南大學(xué);2006年

8 梁亮;C-kit在人胎兒、犬和大鼠食管中的表達(dá)及意義[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2011年

9 劉翠蓮;稀土離子對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化及礦化功能的影響[D];河北大學(xué);2009年

10 張陽(yáng)敏;人胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性研究[D];蘇州大學(xué);2006年

本文編號(hào)：2845095