【研究背景及目的】 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是來源于中胚層的骨髓非造血干細(xì)胞,具有很強(qiáng)的自我更新和多向分化潛能。一直以來,許多研究都在嘗試誘導(dǎo)中胚層的MSCs向上皮層的神經(jīng)元轉(zhuǎn)分化,方法包括:細(xì)胞因子誘導(dǎo)、與神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)、基因轉(zhuǎn)染、化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)等。然而MSCs跨胚層分化為神經(jīng)細(xì)胞的效力不高、比例低下、缺乏神經(jīng)電生理功能、無法滿足臨床及科研的需要,限制了MSCs移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的臨床應(yīng)用。誘導(dǎo)式多潛能干細(xì)胞再程序化技術(shù),是指通過植入新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因,改變細(xì)胞的發(fā)育“記憶”,使其返回到最原始的胚胎發(fā)育狀態(tài),并具有向各胚層分化的潛能。因此,本課題擬采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將在神經(jīng)分化中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子Neurogenin2(Ngn2)轉(zhuǎn)入大鼠MSCs,使細(xì)胞再程序化為骨髓源性ips神經(jīng)干細(xì)胞,再經(jīng)誘導(dǎo)定向分化為功能神經(jīng)元;并初步探索MSCs跨胚層分化的內(nèi)在分子機(jī)制,為進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。 【研究方法】 1.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定,攜帶Ngn2慢病毒液的制備及細(xì)胞轉(zhuǎn)染。 2.無菌條件貼壁法培養(yǎng)大鼠MSCs,擴(kuò)增至第3代為實(shí)驗(yàn)用,流式細(xì)胞儀鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物。構(gòu)建基因重組慢病毒載體,插入綠色熒光蛋白(EGFP)基因作為標(biāo)記。使用高效重組載體和含有目的基因Ngn2的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,進(jìn)行病毒包裝和生產(chǎn),收集病毒液后轉(zhuǎn)染MSCs。 3.細(xì)胞因子誘導(dǎo)Ngn2轉(zhuǎn)染的MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化、鑒定。Ngn2轉(zhuǎn)染的MSCs,先給予含bFGF +EGF的無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),3天后待大部分細(xì)胞長成接近神經(jīng)細(xì)胞樣克隆,然后在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入BDNF作神經(jīng)誘導(dǎo)和分化。免疫細(xì)胞化學(xué)、神經(jīng)電生理,用以鑒定分化成的神經(jīng)細(xì)胞是否具有神經(jīng)細(xì)胞功能。 4.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元的相關(guān)機(jī)制研究已知JAK-STAT3 signaling, ERK signaling, JNK signaling等信號(hào)通路與神經(jīng)元分化密切相關(guān),采用western blot分別檢測轉(zhuǎn)基因前、后,及因子誘分化后的神經(jīng)分化相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá),探索大鼠MSCs神經(jīng)分化的內(nèi)在分子機(jī)制。 【研究結(jié)果】 1.體外貼壁法培養(yǎng)大鼠MSCs,細(xì)胞貼壁生長、生物特性良好、傳代穩(wěn)定。流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果示:CD34 (-), CD45(-) ,CD44(+) ,CD105符合間充質(zhì)細(xì)胞特性。制備含目的基因Ngn2的慢病毒液,滴度為1×108TU/ml,轉(zhuǎn)染大鼠MSCs效率達(dá)93%左右。轉(zhuǎn)染Ngn2基因后的MSCs在培養(yǎng)液中繼續(xù)增殖,細(xì)胞克隆形態(tài)無明顯異常改變。且表達(dá)神經(jīng)前體干細(xì)胞標(biāo)記物如:Nestin、Pax6、Vimentin、Musashi1。 2.骨髓源性ips神經(jīng)干細(xì)胞在體外促神經(jīng)分化因子作用下,細(xì)胞呈神經(jīng)元樣形態(tài)、免疫細(xì)胞化學(xué)檢查發(fā)現(xiàn),細(xì)胞表達(dá)成熟神經(jīng)元相關(guān)標(biāo)記物:MAP2, NeuN, NSE,Western blot蛋白定量檢測也證實(shí)了免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果,膜片鉗電生理也在記錄到且具有神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢幌嚓P(guān)Na~+離子、K~+離子通道。3.Western blot蛋白定量檢測表明,經(jīng)神經(jīng)分化因子誘導(dǎo)后,骨髓源性ips神經(jīng)干細(xì)胞中磷酸化STAT3蛋白表達(dá)明顯低于正常水平,而磷酸化ERK、JNK蛋白表達(dá)升高。 【研究結(jié)論】 1.Ngn2基因轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,可成功制備出骨髓源性ips神經(jīng)干細(xì)胞,并可誘導(dǎo)分化為具有神經(jīng)電生理功能的神經(jīng)元細(xì)胞。 2.骨髓源性ips神經(jīng)干細(xì)胞跨胚層分化為功能神經(jīng)細(xì)胞的分子機(jī)制,可能與抑制STAT3、增強(qiáng)ERK、JNK表達(dá)的信號(hào)通路有關(guān)。
【學(xué)位單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R329
【部分圖文】：

17源性ips神經(jīng)前體干細(xì)胞（P<0.05）。（圖4，5）◆ 圖1， P3代培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞呈長梭形，成纖維樣細(xì)胞，完全融合后類似形成漩渦壯結(jié)構(gòu)（倒置顯微鏡×400）CD45-FITC(-) CD34-PE(-)CD44-PE(+) CD105FITC(+)◆ 圖2 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，通過貼壁法培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白CD34 、CD45 表達(dá)陰性;而間充質(zhì)干細(xì)胞相對(duì)特異性標(biāo)志蛋白CD44，CD105強(qiáng)陽性表達(dá)。

◆ 圖3.培養(yǎng)至P3代的大鼠MSCs，經(jīng)含Neurogenin2的慢病毒液作用五天后，綠色熒顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后的大鼠MSCs綠色熒光蛋白表達(dá)率高達(dá)93%

3代大鼠MSCs轉(zhuǎn)染空載體基因后，westernblot檢測結(jié)果示Neurogenin2蛋白
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2842665