目的：旨在從人的胚胎生殖基中分離出人胚胎生殖脊細胞(hPGCs)，進行體外培養(yǎng)，并證實hPGCs是具有多分化潛能的干細胞；再從hPGCs中得到類胚體(EB)，在EB中得到多分化潛能的干細胞(人EBD細胞，hEBDs)；將hEBDs植入到體內(nèi)，觀察hEBDs在心肌中能否分化為人心肌細胞，以便為hEBDs在心血管方面的研究與將來在臨床上用于冠心病的治療提供理論基礎(chǔ)與實驗依據(jù)。 方法：(1)從發(fā)育5—7周的人肝胎中分離hPGCs，在體外接種于小鼠STO細胞中，進行體外培養(yǎng)；(2)通過形態(tài)學、AKP活性測定及細胞表面標志物SSEA-4與TRA-1-60分析對hPGCs進行鑒定；(3)通過懸浮培養(yǎng)得到類胚體(EB)，從EB中得到多分化潛能的hEBDs，并運用RT-PCR進行鑒定；(4)采用顯微注射法，將DAPI標記的hEBDs注射到發(fā)育第4天的雞胚心肌中；(5)運用人特異性的Alu探針對人、小鼠、大鼠、雞、兔、狗、羊及豬心肌進行DNA原位雜交，以證實Alu探針的人特異性；(6)運用Alu探針DNA原位雜交在術(shù)后存活的雞胚心肌中檢測人細胞的存在；(7)運用免疫熒光技術(shù)分析人細胞陽性的雞胚心肌相鄰切片有無人心肌特異性的標志物ANP、cTnT及Nkx-2.5存在；(8)運用RT-PCR檢測移植hEBDs的雞胚心肌中有無人心肌特異性的標記物MLC-2V、MLC-2A、-MHC、CTnT、ANP與NKx-2.5等存在。 結(jié)果：(1)從發(fā)育5—7周的人胚胎中分離出hPGCs，在體外能連續(xù)傳代；(2)hPGCs在體外能形成克隆，有AKP活性，存在SSEA-4與TRA-1-60表達；(3)通過懸浮培養(yǎng)hPGCs形成EB，消化EB，得到hEBDs，RT-PCR顯示hEBDs表達Myf5、GFAP與α-FP；(4)Alu探針DNA原位雜交在人心肌陽性，而小鼠、大鼠、雞、兔、狗、羊及豬心肌均陰性；(5)Alu探針DNA原位雜交顯示，在注射hEBDs的術(shù)后活的雞胚心肌中，有人細胞存在；(6)免疫熒光顯示存在人細胞的雞胚心肌相鄰切片中有人心肌特異性的標志物ANP、cTnT及Nkx-2.5存在；(7)RT-PCR顯示，移植hEBDs的雞胚心肌中有人心肌特異性的基因MLC-2V、MLC-2A、-MHC、CTnT、ANP與NKx-2.5等表達。 結(jié)論：(1)從人胚胎生殖基中分離出hPGCs具有多分化潛能，進行體外培養(yǎng)能夠得EB，由EB得到的hEBDs也有多分化潛能；(2)hEBDs在體內(nèi)能分化為人心肌細胞，是細胞移植治療冠心病的新的細胞來源。
【學位單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2004
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

心肌;5為第12代的EBD細胞;6為注射EBD細胞的雞胚心肌，7為人心肌;8為為未注射細胞的雞胚心肌;MLC一ZV與MLC一ZA的分子量分別為382bp與381bp圖3一14Rl’-pCR:M為100bp的參照物(Marker);1一4為eThT，5一8為a一MHC;其中1為注射EBD細胞的雞胚心肌;2為人心肌;3為第12代的EBD細胞，4為雞胚心肌;5為注射EBD細胞的雞胚心肌;6為人心肌;7為未注射細胞的雞胚心肌雞胚;8為第12代的EBD細胞。cTnT與a一MHC的分子量分別為巧0bp與413bp圖3一15Rl二pCR:M為100bp的參照物(Marker);1一4為Nkx2.5，5一8為ANp;其中1為人心肌;2為注射EBD細胞的雞胚心肌;3為第12代的EBD細胞，4為雞胚心肌;5為注射EBD細胞的雞胚心肌;6為人心肌;7為未注射細胞的雞胚心肌雞胚;8為第12代的EBD細胞。ANP與Nkx2.5的分子量分別為406bp與233bP

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【參考文獻】

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1 陳運賢,歐瑞明,鐘雪云,徐新,趙洪云,管慧紅,陸英,韓忠朝;自體骨髓干細胞原位移植治療急性心肌梗死的臨床研究[J];中國病理生理雜志;2003年04期

2 王勁,郭朝華,張勇,李軍,冉新澤,徐輝,粟永萍,羅成基,程天民;5-氮雜胞苷誘導間充質(zhì)干細胞分化為成肌細胞的實驗研究[J];中華創(chuàng)傷雜志;2003年04期

3 趙冬,吳兆蘇,王薇,姚麗,周美然;北京地區(qū)1984～1997年急性冠心病事件發(fā)病率變化趨勢(中國MONICA方案的研究)[J];中華心血管病雜志;2000年01期

4 陳緒軍,肖明第,呂志前,盧成寶,薛松,袁忠祥,徐根興;免疫熒光雙標記在心肌石蠟切片中的應用[J];中華醫(yī)學雜志;2004年07期

5 陳緒軍,肖明第,呂志前,盧成寶,袁忠祥,薛松;雞胚心肌內(nèi)移植入人干細胞的動物模型的建立[J];中華醫(yī)學雜志;2004年08期

本文編號：2842167