目的：旨在從人的胚胎生殖基中分離出人胚胎生殖脊細(xì)胞(hPGCs)，進(jìn)行體外培養(yǎng)，并證實(shí)hPGCs是具有多分化潛能的干細(xì)胞；再?gòu)膆PGCs中得到類胚體(EB)，在EB中得到多分化潛能的干細(xì)胞(人EBD細(xì)胞，hEBDs)；將hEBDs植入到體內(nèi)，觀察hEBDs在心肌中能否分化為人心肌細(xì)胞，以便為hEBDs在心血管方面的研究與將來(lái)在臨床上用于冠心病的治療提供理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：(1)從發(fā)育5—7周的人肝胎中分離hPGCs，在體外接種于小鼠STO細(xì)胞中，進(jìn)行體外培養(yǎng)；(2)通過(guò)形態(tài)學(xué)、AKP活性測(cè)定及細(xì)胞表面標(biāo)志物SSEA-4與TRA-1-60分析對(duì)hPGCs進(jìn)行鑒定；(3)通過(guò)懸浮培養(yǎng)得到類胚體(EB)，從EB中得到多分化潛能的hEBDs，并運(yùn)用RT-PCR進(jìn)行鑒定；(4)采用顯微注射法，將DAPI標(biāo)記的hEBDs注射到發(fā)育第4天的雞胚心肌中；(5)運(yùn)用人特異性的Alu探針對(duì)人、小鼠、大鼠、雞、兔、狗、羊及豬心肌進(jìn)行DNA原位雜交，以證實(shí)Alu探針的人特異性；(6)運(yùn)用Alu探針DNA原位雜交在術(shù)后存活的雞胚心肌中檢測(cè)人細(xì)胞的存在；(7)運(yùn)用免疫熒光技術(shù)分析人細(xì)胞陽(yáng)性的雞胚心肌相鄰切片有無(wú)人心肌特異性的標(biāo)志物ANP、cTnT及Nkx-2.5存在；(8)運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)移植hEBDs的雞胚心肌中有無(wú)人心肌特異性的標(biāo)記物MLC-2V、MLC-2A、-MHC、CTnT、ANP與NKx-2.5等存在。 結(jié)果：(1)從發(fā)育5—7周的人胚胎中分離出hPGCs，在體外能連續(xù)傳代；(2)hPGCs在體外能形成克隆，有AKP活性，存在SSEA-4與TRA-1-60表達(dá)；(3)通過(guò)懸浮培養(yǎng)hPGCs形成EB，消化EB，得到hEBDs，RT-PCR顯示hEBDs表達(dá)Myf5、GFAP與α-FP；(4)Alu探針DNA原位雜交在人心肌陽(yáng)性，而小鼠、大鼠、雞、兔、狗、羊及豬心肌均陰性；(5)Alu探針DNA原位雜交顯示，在注射hEBDs的術(shù)后活的雞胚心肌中，有人細(xì)胞存在；(6)免疫熒光顯示存在人細(xì)胞的雞胚心肌相鄰切片中有人心肌特異性的標(biāo)志物ANP、cTnT及Nkx-2.5存在；(7)RT-PCR顯示，移植hEBDs的雞胚心肌中有人心肌特異性的基因MLC-2V、MLC-2A、-MHC、CTnT、ANP與NKx-2.5等表達(dá)。 結(jié)論：(1)從人胚胎生殖基中分離出hPGCs具有多分化潛能，進(jìn)行體外培養(yǎng)能夠得EB，由EB得到的hEBDs也有多分化潛能；(2)hEBDs在體內(nèi)能分化為人心肌細(xì)胞，是細(xì)胞移植治療冠心病的新的細(xì)胞來(lái)源。
【學(xué)位單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

心肌;5為第12代的EBD細(xì)胞;6為注射EBD細(xì)胞的雞胚心肌，7為人心肌;8為為未注射細(xì)胞的雞胚心肌;MLC一ZV與MLC一ZA的分子量分別為382bp與381bp圖3一14Rl’-pCR:M為100bp的參照物(Marker);1一4為eThT，5一8為a一MHC;其中1為注射EBD細(xì)胞的雞胚心肌;2為人心肌;3為第12代的EBD細(xì)胞，4為雞胚心肌;5為注射EBD細(xì)胞的雞胚心肌;6為人心肌;7為未注射細(xì)胞的雞胚心肌雞胚;8為第12代的EBD細(xì)胞。cTnT與a一MHC的分子量分別為巧0bp與413bp圖3一15Rl二pCR:M為100bp的參照物(Marker);1一4為Nkx2.5，5一8為ANp;其中1為人心肌;2為注射EBD細(xì)胞的雞胚心肌;3為第12代的EBD細(xì)胞，4為雞胚心肌;5為注射EBD細(xì)胞的雞胚心肌;6為人心肌;7為未注射細(xì)胞的雞胚心肌雞胚;8為第12代的EBD細(xì)胞。ANP與Nkx2.5的分子量分別為406bp與233bP

咝募∧諳蛉誦募∠赴?只?氖笛檠芯扛吹┐笱Р┦柯畚?圖3一13RT-PeR:1一4為MLe一Zv，5一s為MLe一ZA;M為100bp的參照物(Marker);1為人心肌;2為注射EBD細(xì)胞的雞胚心肌;3為第12代的EBD細(xì)胞，4為未注射細(xì)胞的雞胚心肌;5為第12代的EBD細(xì)胞;6為注射EBD細(xì)胞的雞胚心肌，7為人心肌;8為為未注射細(xì)胞的雞胚心肌;MLC一ZV與MLC一ZA的分子量分別為382bp與381bp圖3一14Rl’-pCR:M為100bp的參照物(Marker);1一4為eThT，5一8為a一MHC;其中1為注射EBD細(xì)胞的雞胚心肌;2為人心肌;3為第12代的EBD細(xì)胞，4為雞胚心肌;5為注射EBD細(xì)胞的雞胚心肌;6為人心肌;7為未注射細(xì)胞的雞胚心肌雞胚;8為第12代的EBD細(xì)胞。cTnT與a一MHC的分子量分別為巧0bp與413bp圖3一15Rl二pCR:M為100bp的參照物(Marker);1一4為Nkx2.5，5一8為ANp;其中1為人心肌;2為注射EBD細(xì)胞的雞胚心肌;3為第12代的EBD細(xì)胞，4為雞胚心肌;5為注射EBD細(xì)胞的雞胚心肌;6為人心肌;7為未注射細(xì)胞的雞胚心肌雞胚;8為第12代的EBD細(xì)胞。ANP與Nkx2.5的分子量分別為406bp與233bP

咝募∧諳蛉誦募∠赴?只?氖笛檠芯扛吹┐笱Р┦柯畚?圖3一13RT-PeR:1一4為MLe一Zv，5一s為MLe一ZA;M為100bp的參照物(Marker);1為人心肌;2為注射EBD細(xì)胞的雞胚心肌;3為第12代的EBD細(xì)胞，4為未注射細(xì)胞的雞胚心肌;5為第12代的EBD細(xì)胞;6為注射EBD細(xì)胞的雞胚心肌，7為人心肌;8為為未注射細(xì)胞的雞胚心肌;MLC一ZV與MLC一ZA的分子量分別為382bp與381bp圖3一14Rl’-pCR:M為100bp的參照物(Marker);1一4為eThT，5一8為a一MHC;其中1為注射EBD細(xì)胞的雞胚心肌;2為人心肌;3為第12代的EBD細(xì)胞，4為雞胚心肌;5為注射EBD細(xì)胞的雞胚心肌;6為人心肌;7為未注射細(xì)胞的雞胚心肌雞胚;8為第12代的EBD細(xì)胞。cTnT與a一MHC的分子量分別為巧0bp與413bp圖3一15Rl二pCR:M為100bp的參照物(Marker);1一4為Nkx2.5，5一8為ANp;其中1為人心肌;2為注射EBD細(xì)胞的雞胚心肌;3為第12代的EBD細(xì)胞，4為雞胚心肌;5為注射EBD細(xì)胞的雞胚心肌;6為人心肌;7為未注射細(xì)胞的雞胚心肌雞胚;8為第12代的EBD細(xì)胞。ANP與Nkx2.5的分子量分別為406bp與233bP
【參考文獻(xiàn)】

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1 陳運(yùn)賢,歐瑞明,鐘雪云,徐新,趙洪云,管慧紅,陸英,韓忠朝;自體骨髓干細(xì)胞原位移植治療急性心肌梗死的臨床研究[J];中國(guó)病理生理雜志;2003年04期

2 王勁,郭朝華,張勇,李軍,冉新澤,徐輝,粟永萍,羅成基,程天民;5-氮雜胞苷誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華創(chuàng)傷雜志;2003年04期

3 趙冬,吳兆蘇,王薇,姚麗,周美然;北京地區(qū)1984～1997年急性冠心病事件發(fā)病率變化趨勢(shì)(中國(guó)MONICA方案的研究)[J];中華心血管病雜志;2000年01期

4 陳緒軍,肖明第,呂志前,盧成寶,薛松,袁忠祥,徐根興;免疫熒光雙標(biāo)記在心肌石蠟切片中的應(yīng)用[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2004年07期

5 陳緒軍,肖明第,呂志前,盧成寶,袁忠祥,薛松;雞胚心肌內(nèi)移植入人干細(xì)胞的動(dòng)物模型的建立[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2004年08期

本文編號(hào)：2842167