痘病毒是自然界最大的病毒，其中最著名的成員是曾給人類帶來深重災(zāi)難的天花病毒，屬于痘病毒科正痘病毒屬。在正痘病毒屬還有另外幾種病毒對人具有一定的感染性，如痘苗病毒、牛痘病毒和猴痘病毒。天花早在上世紀七十年代末就已滅絕，相關(guān)方面的研究目前在國內(nèi)幾乎是空白。但近年來恐怖主義的肆虐行徑使人們認識到生物武器的威脅依然存在，天花病毒仍然是最有可能用作生物武器的病原體。而且隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，其它正痘病毒也可能被改造而具有相似的毒性。對此，除了接種疫苗等預(yù)防措施，進行該類病毒基因水平上的早期檢測十分重要。 基因芯片在病原體檢測方面具有獨特的優(yōu)勢，它以高通量并行檢測基因的方式，使病原體在感染初期還未引起明顯的機體反應(yīng)的時候被檢出，具有快速、高效、敏感、經(jīng)濟和自動化的特點，尤其適宜于大規(guī)模的樣本檢測。 鑒于正痘病毒普遍具有的對人的感染性，對該類病毒進行檢測基因芯片的研制十分必要。目前此類病毒在我國很少存在，本研究克服樣品缺乏的難題，從寡核苷酸芯片的設(shè)計入手，根據(jù)正痘病毒的基因同源性，通過BLAST和痘病毒異源同功基因分析，尋找其保守序列，并進行了基因序列比對工作，在此基礎(chǔ)上根據(jù)寡核苷酸探針原則設(shè)計并合成探針，制備了探針序列已知的寡核苷酸芯片，用于此類病毒的檢測。同時在體外培養(yǎng)正痘病毒的典型代表痘苗病毒，采用RD方法標記了不同感染時段病毒DNA，與芯片雜交，對該芯片進行了應(yīng)用驗證。標記的牛痘病毒DNA與芯片雜交也有明顯的雜交信號，進一步驗證了該芯片用于正痘科病毒檢測的可行性。 痘苗病毒作為痘病毒的最佳研究對象，其體外感染為我們探索正痘病毒侵染機制提供了良好的研究模型。該病毒在基因表達方面的特點是不依賴于宿主系統(tǒng)，自身進行幾乎所有基因的轉(zhuǎn)錄，有一套獨立的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。其基因表達呈現(xiàn)明顯的時段性，分為早期基因和晚期基因。早期基因產(chǎn)物多用于病毒DNA復(fù)制；晚期基因產(chǎn)物則在病毒成熟和感染宿主方面起著重要作用。進入宿主細胞之后，病毒粒子完整的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)首先產(chǎn)生早期 mRNA，包括用于DNA復(fù)制和晚期基因表達的酶和其它因子。晚期mRNA 主要編碼病毒粒子蛋白，也包括早期轉(zhuǎn)錄因子的兩個亞基。對具體功能的 研究通常采用構(gòu)建突變體和回復(fù)突變體的方法進行。目前對這些基因的研 究還不是很充分。本研究利用基因芯片在表達譜應(yīng)用方面的優(yōu)勢，構(gòu)建了 痘苗病毒基因文庫，從克隆片段中采用巢式PCR方法擴增探針，制備了 基因芯片，在病毒感染細胞后3小時和6小時分別提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄 cDNA后采用RD技術(shù)進行標記，通過對不同感染時段病毒基因表達譜的 分析，鑒定了7個早期基因和n個晚期基因，為進一步研究這些基因的 功能打下了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

著孵育時間的延長，病毒繁殖增加，細胞被病毒感染的情況加劇，蝕斑增多、擴大，細胞發(fā)生崩潰。圖1一4正常143TK一細胞Fig.1一4143TK一eell圖1一5病毒感染12hr后的143TK--細胞Fig.1一5143TK一eell;墓/2hrPost一infeetionby滄ee1’Dj日virus圖1一6痘苗病毒感染16hr后143TK一細胞Fig.1一6143TK一eell16hrPost一infeetionbyVacej刀1’avirus圖1一7痘苗病毒感染24hr的后的143TK一細胞Fig.1一7143TK一eell24hrPost一infeetionby吃cc勁了avirus

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著孵育時間的延長，病毒繁殖增加，細胞被病毒感染的情況加劇，蝕斑增多、擴大，細胞發(fā)生崩潰。圖1一4正常143TK一細胞Fig.1一4143TK一eell圖1一5病毒感染12hr后的143TK--細胞Fig.1一5143TK一eell;墓/2hrPost一infeetionby滄ee1’Dj日virus圖1一6痘苗病毒感染16hr后143TK一細胞Fig.1一6143TK一eell16hrPost一infeetionbyVacej刀1’avirus圖1一7痘苗病毒感染24hr的后的143TK一細胞Fig.1一7143TK一eell24hrPost一infeetionby吃cc勁了avirus
【引證文獻】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 馬孟根;豬源致病性沙門氏菌耐藥基因PCR和基因芯片檢測技術(shù)研究[D];四川大學(xué);2005年

本文編號：2837659