HBV和HCV是臨床上最常見、危害最大的兩種肝炎病毒,其長期持續(xù)的慢性感染與肝硬化、肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。隨著人們對肝炎病毒認(rèn)識的不斷深入,尤其是肝炎病毒基因組學(xué)研究的進(jìn)展,使臨床上現(xiàn)有的血清免疫學(xué)方法和以單一PCR技術(shù)為主的檢測方法其局限性越來越明顯,由于不能真實(shí)、全面地反映患者體內(nèi)病毒基因組的各種變異和動態(tài)變化,對患者個(gè)體的針對性診斷和治療也受到很大限制。為及時(shí)將肝炎病毒的基因研究成果應(yīng)用于臨床實(shí)踐,需要利用新的分子生物醫(yī)學(xué)技術(shù),研究和開發(fā)肝炎病毒的新型診斷方法和診斷試劑。據(jù)此,我們重點(diǎn)研究了HBV和HCV基因診斷芯片的制備、應(yīng)用,以及新型肝炎病毒SENV的實(shí)驗(yàn)研究。 本文涉及的實(shí)驗(yàn)方法包括生物信息學(xué)分析(即芯片上探針和PCR引物的設(shè)計(jì)、測序序列的檢索和比對)、探針和PCR引物的合成、PCR產(chǎn)物直接測序、基因芯片上探針的點(diǎn)樣制備方法、血清中病毒的提取方法、PCR擴(kuò)增和地高辛標(biāo)記、分子雜交及顯色、芯片雜交結(jié)果的數(shù)據(jù)處理等。芯片制備過程中的優(yōu)化環(huán)節(jié)包括:尼龍膜型號和探針固定照射劑量的選擇,探針3′末端加尾堿基數(shù)的確定,利用探針的互補(bǔ)寡核苷酸序列和部分PCR產(chǎn)物的測序驗(yàn)證芯片雜交的特異性,利用PCR擴(kuò)增直接參入地高辛信號分子,分析其長度、濃度及雜交時(shí)間對雜交信號的影響,比較了HBV標(biāo)本的不同處理方法和不同PCR引物組合的擴(kuò)增效率。經(jīng)過二年多的反復(fù)實(shí)驗(yàn)研究,初步完成HBV基因芯片、HCV基因芯片和HBV、HCV聯(lián)檢芯片的制備。 在HBV基因芯片的研制過程中,先后制備了HBV-450S、HBV-90S、HBV-120S、HBV-P/S區(qū)75S和HBV-C/X區(qū)25S等不同點(diǎn)陣數(shù)的基因芯片。最早的HBV-450S芯片包含的基因信息最豐富,理論上可檢測HBV的7種基因型、4種血清亞型、4個(gè)P基因耐藥相關(guān)的突變位點(diǎn)、2個(gè)S抗原突變位點(diǎn)、6個(gè)C區(qū)變異和X區(qū)的缺失突變,但部分探針特異性較差。在隨后的改進(jìn)中,HBV-P/S區(qū)75S是目前臨床實(shí)驗(yàn)研究較好的芯片,對基因型、血清亞型和拉米夫定耐藥突變均能特異檢測。同時(shí),利用制備的HBV基因芯片,對45例納入葛蘭素威康公司評價(jià)新藥拉米夫定療效臨床研究的乙肝患者、270例三中心醫(yī)院的門診慢性乙型肝炎患者和466例來自6個(gè)
【學(xué)位單位】：南開大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

一．基因芯片實(shí)驗(yàn)體系的優(yōu)化1．基因芯片的制備和雜交條件的選擇利用本文設(shè)計(jì)的 HBV 寡核苷酸探針和對應(yīng) PCR 引物，對基因芯片制作過程實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化，包括微陣列制備、選擇尼龍膜、探針加尾方式、膜的照和雜交時(shí)間的選擇等步驟，建立了一套具有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因芯片操作①尼龍膜的選擇。最初實(shí)驗(yàn)時(shí)我們只利用一家公司的膜和 TDT 末端轉(zhuǎn)移酶備芯片微陣列，但發(fā)現(xiàn)顯色結(jié)果不穩(wěn)定，促使我們購買 4 種尼龍膜進(jìn)行實(shí)驗(yàn)涉及商業(yè)開發(fā)，暫且將 4 種膜編號 N1、N2、N3 和 N4 型。多次反復(fù)雜交結(jié)括手點(diǎn)膜）驗(yàn)證 N4 型膜效果最好，雜交結(jié)果最穩(wěn)定。部分結(jié)果見圖 1。

3-D1 3-D2 3-E1 3-E2圖 3. 不同照射劑量和雜交時(shí)間對芯片雜交的影響A～E 代表 5 個(gè) PCR 標(biāo)記產(chǎn)物（產(chǎn)物量經(jīng)電泳和測 OD 值后調(diào)整為一致濃度）對不同照射劑量的兩張膜（HBV-120S 芯片）背對背在同一雜交代內(nèi)的雜交結(jié)果。A1 和 A2 的照射劑量分別 2 倍、3 倍，雜交時(shí)間 1hr；A3 和 A4 的照射劑量分別 2 倍、3 倍，雜交時(shí)間 2hr；B1 和 B2的照射劑量分別 4 倍、5 倍，雜交時(shí)間 4hr；C1 和 C2 的照射劑量分別 6 倍、7 倍，雜交時(shí)間過夜；D1 和 D2 的照射劑量分別 9 倍、18 倍，雜交時(shí)間 4hr；E1 和 E2 的照射劑量分別 11 倍、15倍，雜交時(shí)間 2hr。

484-E1 4-E2圖 4. 不同引物組合和處理方法的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖A1～B2 為 S/P 區(qū)的 20 對引物 PCR 擴(kuò)增，使用 107標(biāo)本進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，A1、A2 為浩源公司的堿裂解法，B1、B2 為自配煮法裂解液③。C 為 S/P 區(qū)的 5 對引物擴(kuò)增，前 5 個(gè)電泳條帶為自配煮法裂解液③，后 5 個(gè)電泳條帶為血清直接煮法。D1～E2 為 C/X 區(qū)的 15 對引物 PCR 擴(kuò)增，使用 107標(biāo)本進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，D1、D2 為浩源公司的堿裂解法，E1、E2 為自配煮法裂解液③。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2837362