人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是重要的性傳播因子，可引起人皮膚粘膜的增生性疾病及惡性腫瘤。根據HPV與良惡性病變的關系分為低危組和高危組。HPV16是高危組最重要的基因型，與宮頸癌等泌尿生殖系惡性腫瘤的發(fā)生密切相關，除此之外還與口腔癌、肺癌、食管癌的發(fā)生具有一定的關系。我組多年攻關研究及國外報道均表明：HPV16E6及E7為病毒的主要轉化基因，E6及E7的表達為癌細胞惡性表型維持所必須。流行病調查資料顯示：人群感染HPV16后，可產生抗HPV16E6及E7特異免疫。因而，研制防治HPV16相關疾病的疫苗，E6和E7是理想的靶抗原。 由于E6及E7為病毒轉化基因，利用E6及E7基因直接作為疫苗具有潛在的致癌性，因此去除E6及E7的轉化活性，保留其抗原性是利用E6及E7研制疫苗的前提。文獻報道表明E7第24位氨基酸的突變可廢除E7的轉化活性。為了涵蓋較多的抗原表位，本研究擬利用中國宮頸癌標本中E6及E7基因作為疫苗研究的靶基因。定點突變E7的第24位氨基酸，敲除E7的轉化活性，然后對E6的終止密碼區(qū)進行突變修飾，構建E6E7融合基因fmE6E7(fused and mutated E6E7gene，fmE6E7)，在證實fmE6E7的轉化活性敲除之后，用于DNA疫苗的構建及研究。 根據T淋巴細胞活化的雙信號學說和MHC(major histocomplex)I類分子呈遞抗原的規(guī)律，為了有效地活化T細胞，本研究構建淋巴細胞活化所必需的共刺激分子B7-1的真核表達質粒pcDNA3.1-B7-1，采用裸DNA肌肉接種的免疫方式，使E6E7在機體組織細胞內翻譯成蛋白進入MHCI類分子抗原呈遞途徑，同時輔以共激活分子B7-1基因共同免疫，以期有效地活化機體的免疫反應，特別是CTL(cytotoxic T lymphocyte，CTL)活性。獲得以下結果： 1．首先對宮頸癌標本中HPV的感染型別進行檢測，14例宮頸癌活檢標本中，
【學位單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2002
【中圖分類】：Q78;R392
【部分圖文】：

97“43引2114娜圖1一13Westemblotting鑒定重組質粒在細胞內的表達F191一13WestenrblottingidentifieationoftheexPerssionProduetofreeombinantPlasmidintransefetnatCe!!5.1.3T3一neo;2.3T3一E6E7;3.3T3一mfE6E7.倉，圖1一14轉染細胞的軟瓊脂細胞集落形成分析Figl一14Foeiofmrationnaalysisoftnarsefetedeellsonsotfagar‘A.3T3一E6E7;B.3T3一mfE6E7;C.3T3一neo.圖1一153T3一E6E7組瘤組織的光鏡觀察Figl一15LightmierogrPahoftumortissueingrouP3T3一E6E7inoeulation

泄??鴕嬌迫搜Т喲∫窖г翰?:論文第二部分實驗結果定向克隆入pVR1012載體內，經Xbal、Bam川雙酶切，電泳可見重組載體酶切釋放出約776bp的片段(如圖2一2)，與E6E7片段長度一致，該重組質粒命名為pVR1012一mfE6E7�！�2345776bP圖2一ZpVRlolZ·mfE6E7質粒的酶切鑒定F192一2IdentifieationofthereeombinantPlasmidsPVR1012·mfE6E7入DNA/Hindlllmarker:2.PBR322DNA/BstNImarker:3.PVR1012一mfE6E7digestedwithbyXbalandBamHI:4.PVR1012一mfE6E7:5.PVR1012..1.2.pVR1012一mfE6E7重組質粒體外在Cos一7細胞中的表達J指質體法將pVR1012一mfE6E7轉染Cos一7細胞，48小時后收獲細胞，以C3細胞為陽性對照，pvR1012空載轉染組為陰性對照。間接免疫熒光染色結果如圖2一3所示:C3細胞及轉染pvRI012一mfE6E7細胞的細胞核及核周圍呈黃綠色陽性信號，而陰性對照組為陰性，表明pvR1012一mfE6E7可在Cos一7細胞中表達。圖2一3免疫熒光組織化學法檢測pvR1012一mfE6E7重組質粒體外在COs一細胞中的表達F192一3ImmunofiuerseeneenaalysistheexPressionofPVR1012一mfE6E7

泄??鴕嬌迫搜Т喲∫窖г翰?:論文第二部分實驗結果定向克隆入pVR1012載體內，經Xbal、Bam川雙酶切，電泳可見重組載體酶切釋放出約776bp的片段(如圖2一2)，與E6E7片段長度一致，該重組質粒命名為pVR1012一mfE6E7�！�2345776bP圖2一ZpVRlolZ·mfE6E7質粒的酶切鑒定F192一2IdentifieationofthereeombinantPlasmidsPVR1012·mfE6E7入DNA/Hindlllmarker:2.PBR322DNA/BstNImarker:3.PVR1012一mfE6E7digestedwithbyXbalandBamHI:4.PVR1012一mfE6E7:5.PVR1012..1.2.pVR1012一mfE6E7重組質粒體外在Cos一7細胞中的表達J指質體法將pVR1012一mfE6E7轉染Cos一7細胞，48小時后收獲細胞，以C3細胞為陽性對照，pvR1012空載轉染組為陰性對照。間接免疫熒光染色結果如圖2一3所示:C3細胞及轉染pvRI012一mfE6E7細胞的細胞核及核周圍呈黃綠色陽性信號，而陰性對照組為陰性，表明pvR1012一mfE6E7可在Cos一7細胞中表達。圖2一3免疫熒光組織化學法檢測pvR1012一mfE6E7重組質粒體外在COs一細胞中的表達F192一3ImmunofiuerseeneenaalysistheexPressionofPVR1012一mfE6E7
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本文編號：2837218