發(fā)布時間：2020-10-08 17:27

　　 中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central Nervous System，CNS）主要由兩類細(xì)胞組成——神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)的間質(zhì)和支持細(xì)胞，對神經(jīng)元的存活、分化、遷移、突觸聯(lián)系和神經(jīng)沖動傳導(dǎo)等均起到重要的調(diào)節(jié)作用，膠質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)已逐漸成為當(dāng)前神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。腦內(nèi)的膠質(zhì)細(xì)胞主要有三類：星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。本研究主要關(guān)注少突膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及損傷后修復(fù)中的相關(guān)作用機(jī)制。 少突膠質(zhì)細(xì)胞（oligodendrocytes，OLs）由少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（oligodendrocyteprecursor cells，OPCs）經(jīng)過增殖、遷移、分化形成，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)唯一的成髓鞘細(xì)胞。在脊椎動物，神經(jīng)系統(tǒng)中軸突髓鞘化的順利完成以及髓鞘的完整性是維持軸突絕緣和實現(xiàn)動作電位跳躍式傳導(dǎo)的重要保證，在進(jìn)化上具有重要意義。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及修復(fù)所涉及到的髓鞘化過程中，少突膠質(zhì)細(xì)胞的遷移扮演了重要的角色。然而，精確調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)細(xì)胞遷移的細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)機(jī)制目前尚未研究清楚。近年來的研究顯示，Slits蛋白家族可通過與其受體Robos的結(jié)合，調(diào)節(jié)諸多神經(jīng)發(fā)育過程中的事件，例如細(xì)胞的遷移、粘附、軸突導(dǎo)向和延伸。Slit2在運(yùn)動神經(jīng)元區(qū)域具有高表達(dá)，而這一區(qū)域正是OPCs產(chǎn)生的區(qū)域；Slit2在大鼠腹側(cè)脊髓維持高表達(dá)水平而在背側(cè)脊髓低表達(dá)。這些空間表達(dá)特征提示，Slit2有可能參與了對OPCs遷移過程的調(diào)節(jié)，然而迄今尚未見Slit2在OPCs遷移中的作用的研究報道。 OLs通過形成髓鞘，促進(jìn)神經(jīng)沖動轉(zhuǎn)導(dǎo)，并維持軸突完整性。神經(jīng)損傷后，髓鞘崩解，并釋放多種降解產(chǎn)物，能夠抑制神經(jīng)軸突的再生。這些降解產(chǎn)物被稱為髓鞘相關(guān)抑制因子（myelin-associated inhibitory factors，MAIFs）。目前已鑒定出五個MAIFs，其中Nogo、髓鞘相關(guān)糖蛋白（myelin-associated glycoprotein，MAG）以及少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白（oligodendrocyte myelin glycoprotein，OMgp）能夠直接與同一個受體，Nogo受體復(fù)合物，結(jié)合并發(fā)揮功能。最初鑒定的Nogo受體復(fù)合物由三個部分組成：Nogo受體（NgR）、p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體（p75neurotrophin receptor，p75）和LINGO-1，之后的研究發(fā)現(xiàn)，TROY受體可以功能性地替代p75，參與組成Nogo受體復(fù)合物，即構(gòu)成NgR/TROY/LINGO-1受體復(fù)合物。這一三聯(lián)受體復(fù)合物與配體結(jié)合后，激活其下游的小G蛋白RhoA GTP酶，引起神經(jīng)元生長錐塌陷、軸突再生抑制。目前已知神經(jīng)突起生長的抑制依賴于TROY介導(dǎo)的RhoA激活，但TROY是通過何種機(jī)制激活其下游的RhoA，迄今尚不清楚。 本研究運(yùn)用多種實驗手段，對少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的遷移機(jī)制以及髓鞘相關(guān)抑制因子的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，旨在深入認(rèn)識神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞相互作用機(jī)制，以期為設(shè)計與開發(fā)促進(jìn)神經(jīng)再生與修復(fù)的策略開創(chuàng)新思路。本研究取得的主要結(jié)果如下： 1.軸突導(dǎo)向分子Slit2通過Fyn-RhoA信號通路調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的遷移 我們的研究顯示：（1）運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫組織化學(xué)、RT-PCR及Western-Blot實驗方法，明確了在體外培養(yǎng)的以及體內(nèi)OPCs中均表達(dá)Robos受體；（2）運(yùn)用Transwell小室遷移實驗，發(fā)現(xiàn)Slit2可以排斥OPCs的遷移，并且這種排斥效應(yīng)與Slit2的濃度有關(guān)；（3）運(yùn)用Robos受體的特異性抑制物RoboN進(jìn)行Transwell小室遷移實驗，可以顯著減弱Slit2的這一效應(yīng)；（4）用Slit2蛋白處理體外培養(yǎng)的OPCs，觀察到OPCs中Fyn活化水平降低，而RhoA的活化水平升高；（5）運(yùn)用免疫共沉淀實驗（Co-IP）發(fā)現(xiàn)，OPCs中的Fyn可與Robo1相互作用，并且，對OPCs給予Slit2刺激后，F(xiàn)yn和Robo1的結(jié)合強(qiáng)度下降。本部分結(jié)果表明，Slit2與其受體Robo1的結(jié)合能夠通過Fyn和RhoA信號通路調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的遷移。 2. TROY受體與RhoGDIα的相互作用參與了Nogo-66介導(dǎo)的神經(jīng)突起生長抑制作用 我們的研究顯示：（1）利用GST（glutathione S-transferase，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶）pull-down技術(shù)聯(lián)合二維電泳、質(zhì)譜分析，鑒定出RhoGDIα是TROY的一個結(jié)合分子；采用免疫共沉淀（Co-IP）的方法在體外培養(yǎng)的細(xì)胞和組織水平進(jìn)一步確證了TROY與RhoGDIα的結(jié)合；（2）缺失突變分析結(jié)果顯示，TROY胞內(nèi)段（ICD）的234-356aa（amino acids）和321-350aa兩段序列介導(dǎo)了TROY與RhoGDIα的結(jié)合；（3）運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫組織化學(xué)方法，在出生后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脊髓背根神經(jīng)元（DRG）、大腦皮層神經(jīng)元以及小腦顆粒神經(jīng)元（cerebellar granule neurons，CGNs）中均檢測到了TROY和RhoGDIα的共定位；（4）Nogo-66能夠增強(qiáng)TROY/RhoGDIα的相互作用，且TROY/RhoGDIα的相互作用是p75非依賴性的；（5）在p75基因敲除小鼠的神經(jīng)元中，TROY/RhoGDIα的相互作用仍然可介導(dǎo)RhoA的激活；（6）在野生型和p75敲除的小腦顆粒神經(jīng)元中過表達(dá)RhoGDIα能夠阻斷Nogo-66介導(dǎo)的RhoA的激活以及隨后的神經(jīng)突起生長抑制。本部分結(jié)果表明，RhoGDIα與TROY的相互作用參與了Nogo-66介導(dǎo)的依賴于TROY的RhoA活化，并抑制了神經(jīng)突起生長。 綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)：Slit2作為一個軸突排斥性導(dǎo)向分子，能夠在發(fā)育過程中以排斥性的方式調(diào)節(jié)OPCs的遷移；TROY作為髓鞘相關(guān)抑制因子受體的一個組成成分，可以通過與RhoGDIα的相互作用介導(dǎo)髓鞘相關(guān)抑制因子的神經(jīng)突起抑制作用。這一研究有助于深入認(rèn)識神經(jīng)發(fā)育與再生過程中神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞相互作用的機(jī)制。
【學(xué)位單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R338
【文章目錄】：
摘要
Abstract
中英文縮略詞
第一部分：Slit2通過Fyn/RhoA信號通路調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的遷移
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
第二部分：TROY與RhoGDIct結(jié)合調(diào)節(jié)Nogo介導(dǎo)的神經(jīng)突起生長抑制
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述
    參考文獻(xiàn)
在讀期間發(fā)表論文情況和參加科研工作情況
致謝

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2832538