本文關(guān)鍵詞：人胎盤泌乳素的原核表達(dá)、純化及其多克隆抗體制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人胎盤泌乳素（human placenta lactogen，hPL）又叫人絨毛膜生長催乳激素（chorionic somatomammotropin hormone，CSH），是由胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞合成并分泌入血的一種妊娠特異性激素。hPL基因位于第17號染色體上，其成熟肽具有191個(gè)氨基酸，分子量約為23000Da，是一種單鏈多肽類激素，分子內(nèi)有兩個(gè)二硫鍵。孕早期（5~6周）即可從母體外周血中檢出，孕34~38周達(dá)到峰值，此后一直維持峰值至分娩。hPL具有促進(jìn)乳腺發(fā)育、促進(jìn)胎兒宮內(nèi)生長發(fā)育、增加巨噬細(xì)胞表面受體表達(dá)等重要功能。當(dāng)胎盤發(fā)生病理改變時(shí)，hPL的表達(dá)量相對降低。因此，測定母血中hPL的濃度，可以反映合體滋養(yǎng)細(xì)胞的狀態(tài)，進(jìn)而判斷胎盤功能。妊娠晚期母血hPL水平還可以間接反映胎盤體積、重量和胎兒體重。動(dòng)態(tài)監(jiān)測不同妊娠時(shí)期hPL水平是監(jiān)護(hù)高危妊娠、預(yù)測妊娠結(jié)局、了解胎兒宮內(nèi)生長發(fā)育狀況和指導(dǎo)臨床診斷的一項(xiàng)可信參考指標(biāo)。近幾年來，孕期hPL檢測已經(jīng)逐漸受到臨床醫(yī)生的重視，這就需要大量的hPL蛋白標(biāo)準(zhǔn)品及抗hPL抗體，天然hPL蛋白來源有限且難于提純，原核表達(dá)hPL蛋白可以有效改善其不足。本文主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 1. hPL基因的克隆及原核表達(dá)載體pQE30-hPL的構(gòu)建 根據(jù)GeneBank提供的hPL基因序列（NM_001317.3），利用primer5.0軟件針對成熟肽基因序列設(shè)計(jì)引物，上下游引物分別引入BamHI和HindⅢ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。從人胎盤組織中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出hPL基因成熟肽編碼區(qū)。 2. hPL的表達(dá)、純化及復(fù)性 構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)M15(pREP4)/pQE-30-hPL，并以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出相對分子質(zhì)量（M r）約為23000Da的包涵體蛋白，表達(dá)量占菌體總蛋白的67%。 包涵體蛋白經(jīng)8M尿素變性后，應(yīng)用Sephacryl S-200凝膠過濾層析純化，經(jīng)鑒定純化后蛋白純度大于90%，回收率達(dá)到60%。 應(yīng)用Cu2+氧化稀釋復(fù)性法、尿素濃度梯度透析復(fù)性法和色譜柱復(fù)性法，促進(jìn)變性包涵體蛋白鏈內(nèi)二硫鍵的形成，紅系集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，原核表達(dá)的hPL蛋白復(fù)性后具有良好生物學(xué)活性。 Western blot法鑒定分析，純化后hPL蛋白能與商品化的山羊抗hPL抗體特異性結(jié)合，顯示出較好的抗原性及特異性。 3. hPL多克隆抗體制備 高純度hPL蛋白免疫家兔，，得到兔抗血清。間接ELISA法測定其效價(jià)大于1:51200，陽性對照的包被抗原選擇了商品化ELISA試劑盒中的hPL標(biāo)準(zhǔn)品，兔抗血清能與其抗原決定簇結(jié)合，證實(shí)抗體具有較好的反應(yīng)性。以純度高的抗原免疫機(jī)體獲得了高效價(jià)的抗體，表明原核表達(dá)的hPL蛋白具有較好的免疫原性。 本研究，篩選得到了M15(pREP4)/pQE-30-hPL菌株，能夠穩(wěn)定攜帶重組質(zhì)粒pQE-30-hPL。攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌經(jīng)誘導(dǎo)后能高效表達(dá)hPL蛋白。建立了hPL包涵體蛋白純化工藝。包涵體蛋白經(jīng)過復(fù)性處理后具有良好生物學(xué)功能。原核表達(dá)的hPL蛋白抗原性及免疫原性良好，經(jīng)純化及進(jìn)一步優(yōu)化后有望作為抗原標(biāo)準(zhǔn)品。制備得到了高滴度有較好特異性的兔抗hPL多克隆抗體。綜上，本文為hPL及其抗體的進(jìn)一步臨床應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：人胎盤泌乳素 原核表達(dá) 純化 復(fù)性 多克隆抗體
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392;Q78
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第1章 引言12-18
• 1. hPL 的結(jié)構(gòu)12-15
• 1.1 hPL 基因12-14
• 1.2 hPL 分子14-15
• 2. hPL 的生理作用15-16
• 2.1 生長促進(jìn)作用15
• 2.2 催乳作用15
• 2.3 外周血管收縮作用15-16
• 2.4 對瘦素分泌的影響16
• 2.5 對單核細(xì)胞 CD163、CD14 表達(dá)的影響16
• 3. hPL 的臨床意義16-17
• 4. 本研究的主要內(nèi)容17-18
• 第2章 材料方法18-37
• 1. 主要材料試劑及實(shí)驗(yàn)設(shè)備18-24
• 1.1 菌株和質(zhì)粒18
• 1.2 主要試劑18-19
• 1.3 各種試劑的配制19-23
• 1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物23
• 1.5 主要儀器設(shè)備23-24
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法24-37
• 2.1 hPL 基因的克隆及原核表達(dá)載體 pQE30-hPL 的構(gòu)建24-30
• 2.2 hPL 的表達(dá)、純化、復(fù)性及其活性鑒定30-35
• 2.3 hPL 多克隆抗體的制備35-37
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-49
• 1. hPL 基因的克隆37
• 2. TA 克隆37-39
• 2.1 pMD18-T 克隆載體37-38
• 2.2 重組克隆載體 pMD18-T-hPL 鑒定38-39
• 3. 原核表達(dá)載體 PQE-30-hPL 的構(gòu)建39-43
• 3.1 pQE-30 質(zhì)粒39-40
• 3.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定40-41
• 3.3 重組質(zhì)粒的測序鑒定41
• 3.4 hPL-A 基因 CDS 序列41-42
• 3.5 hPL 的氨基酸序列及分子內(nèi)二硫鍵42-43
• 4. hPL 的表達(dá)43-44
• 4.1 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定43-44
• 4.2 誘導(dǎo)劑濃度及誘導(dǎo)時(shí)間的確定44
• 5. 包涵體 hPL 蛋白的純化鑒定44-46
• 6. 原核表達(dá) hPL 蛋白的特異性鑒定46-47
• 6.1 Western blot 分析46
• 6.2 ELISA 分析46-47
• 7. 原核表達(dá) hPL 蛋白的復(fù)性鑒定47
• 8. hPL 多克隆抗體的檢測47-49
• 第4章 討論49-53
• 第5章 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-61
• 作者簡介及在學(xué)期間所取得的科研成果61-62
• 致謝62

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：人胎盤泌乳素的原核表達(dá)、純化及其多克隆抗體制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：281751