背景與目的 呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）是世界范圍內(nèi)嬰幼兒下呼吸道感染最重要的病毒病原。RSV還是嬰幼兒猝死綜合征的主要病因以及院內(nèi)感染的主要病原體和成人急性呼吸道感染的病原之一。目前尚無安全有效的疫苗和藥物控制RSV感染。RSV為一負(fù)鏈RNA病毒，其序列已清楚。RSV基因組RNA上的某些序列的完整性對(duì)病毒復(fù)制極為重要。RSV復(fù)制須首先合成RNA中間產(chǎn)物，在某些區(qū)域內(nèi)切斷基因組RNA，可使中間產(chǎn)物RNA無法產(chǎn)生從而阻斷RSV復(fù)制。已有作者證實(shí)在基因組RNA NS2基因片段內(nèi)磷酸二酯鍵部位進(jìn)行切斷可有效阻斷RSV復(fù)制。RSV可以基因組負(fù)鏈RNA為模板，依靠病毒自身攜帶的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄mRNA，再將mRNA上的遺傳信息翻譯為病毒蛋白。選擇適合的位點(diǎn)分解RSV的mRNA可阻斷某些病毒蛋白的合成。 脫氧核酶(DNAzyme/Deoxyribozyme)是繼核酶（Ribozyme）之后又一種嶄新的分子生物學(xué)工具。脫氧核酶由具有RNA內(nèi)切酶活性的堿基環(huán)和根據(jù)靶RNA序列設(shè)計(jì)的兩條側(cè)臂構(gòu)成。側(cè)臂可通過堿基互補(bǔ)原則高度特異地將堿基環(huán)固定到靶位點(diǎn)上，并在一個(gè)未配對(duì)的嘌呤 WP=8 和一個(gè)已配對(duì)的嘧啶之間將靶RNA切斷。目前，脫氧核酶的應(yīng)用研究在病毒感染性疾病、腫瘤、心血管疾病以及遺傳性疾病等方面已取得不同程度的進(jìn)展，但有關(guān)脫氧核酶抗RSV感染的研究尚未見報(bào)道。 本研究針對(duì)RSV基因組RNA以及mRNA的不同位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成抗RSV脫氧核酶，觀察其在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的抗RSV效應(yīng)，為使用脫氧核酶控制RSV感染提供理論依據(jù)。 方法 以Santoro等報(bào)告的10-23脫氧核酶為核心，針對(duì)RSV NS2基因起始區(qū)設(shè)計(jì)3個(gè)脫氧核酶：DZ595、DZ604和RSV2UDZ（NS1-2）；針對(duì)RSV M2mRNA設(shè)計(jì)3個(gè)脫氧核酶：DZ8269、DZ8277和DZ RSV2UDZ（M2）并在無細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行篩選。以猴腎細(xì)胞Vero為RSV繁殖細(xì)胞，選擇人氣道上皮細(xì)胞9HTE為RSV的靶細(xì)胞，觀察RSV在人氣道上皮細(xì)胞株9HTE細(xì)胞中的致細(xì)胞病變效應(yīng)，建立穩(wěn)定的RSV感染的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。使用經(jīng)無細(xì)胞系統(tǒng)篩選證實(shí)具有底物切割活性的脫氧核酶DZ604，在RSV感染的9HTE細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中分別觀察：脫氧核酶對(duì)RSV致9HTE細(xì)胞病變的影響；脫氧核酶對(duì)RSV空斑形成的阻斷效應(yīng)；脫氧核酶對(duì)RSV所致的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化的影響；脫氧核酶對(duì)RSV所致的細(xì)胞周期變化的影響；四唑鹽（MTT）比色試驗(yàn)檢測(cè)不同濃度脫氧核酶對(duì)RSV感染的9HTE細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢(ELISA)測(cè)脫氧核酶對(duì)RSV蛋白表達(dá)的影響；脫氧核酶、脫氧核酶突變體（mRDZ）、非特異性脫氧核酶以及利 WP=9 巴韋林抗RSV效應(yīng)的比較；脫氧核酶抗麻疹病毒效應(yīng)以及脫氧核酶對(duì)9HTE細(xì)胞的毒性作用。 結(jié)果 DZ595、DZ604和RSV2UDZ（NS1-2）均能切割RSV NS1/2RNA底物，以DZ604的作用最強(qiáng)；DZ8269和DZ8277能切割RSV M2mRNA底物，RSV2UDZ（M2）未顯示底物切割活性；抗RSV基因組RNA脫氧核酶不能切割RSV M2mRNA底物；抗RSV M2mRNA脫氧核酶不能切割RSV NS1/2RNA底物。 我們成功建立了穩(wěn)定的9HTE細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)：RSV感染9HTE細(xì)胞后可出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，以細(xì)胞圓縮脫落為主，融合性病變較少；病變出現(xiàn)的早晚和病變的程度與MOI有密切關(guān)系，當(dāng)MOI為10、1時(shí)，感染細(xì)胞在12小時(shí)內(nèi)迅速圓縮脫落并很快裂解死亡，當(dāng)MOI逐漸減小時(shí)，細(xì)胞病變出現(xiàn)的時(shí)間則越來越晚，全部細(xì)胞均發(fā)生病變的時(shí)間也越來越長(zhǎng)，當(dāng)MOI為0 0001時(shí)，細(xì)胞在感染5天后才出現(xiàn)病變，全部細(xì)胞均發(fā)生病變則在感染12天后。脫氧核酶在RSV感染的9HTE細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的抗病毒效應(yīng)：脫氧核酶對(duì)RSV所致細(xì)胞病變的改善作用與RSV的感染量有關(guān)，同一濃度脫氧核酶（5μmol /L），當(dāng)RSV感染量較大（MOI = 10，1）時(shí)，其改善細(xì)胞病變的作用不明顯；當(dāng)RSV感染量較�。∕OI = 0 1,0 01,0 001,0 0001）時(shí)，脫氧核酶可明顯改善RSV所致的細(xì)胞病變，治療組病變出現(xiàn)時(shí)間和完全病變時(shí)間延遲，隨著MOI的逐漸減小，效果逐漸增強(qiáng)（P 0 05）。當(dāng)脫氧核 WP=10 酶濃度為5μmol/L時(shí)，RSV減少的百分率可達(dá)85 56%，當(dāng)脫氧核酶濃度降低至0 25μmol/L時(shí)，RSV減少的百分率僅為8 33%，脫氧核酶對(duì)病毒抑制效應(yīng)與其濃度有關(guān)，濃度越高，效果越明顯(P 0 05)。細(xì)胞感染RSV后發(fā)生 G0-G1期阻滯，S期細(xì)胞數(shù)減少，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，G0-G1期阻滯進(jìn)一步加劇，S期細(xì)胞數(shù)繼續(xù)減少，G2-M期也受到影響而開始減少，細(xì)胞周期FACS分析表明，脫氧核酶可不同程度逆轉(zhuǎn)RSV感染所致的細(xì)胞周期變化（P0 01）。脫氧核酶濃度為5μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率達(dá)81 91%，當(dāng)脫氧核酶濃度降至0 25μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率為50 45%，脫氧核酶能提高細(xì)胞感染RSV后的存活率，濃度越高，細(xì)胞存活率越高（P 0 001）。脫氧核酶濃度為5μmol/L時(shí)，其RSV抑制率是72 01%，當(dāng)脫氧核酶濃度降至0 25μmol/L時(shí)，RSV抑制率為23 33%，脫氧核酶濃度與RSV抑制率之間存在劑量依賴關(guān)系，濃度越高，對(duì)RSV的抑制作用越強(qiáng)（ P 0 05）。脫氧核酶顯著降低RSV的蛋白表達(dá)，即使?jié)舛葹? 25μmol/L時(shí)，脫氧核酶對(duì)RSV蛋白的產(chǎn)生仍有明顯抑制作用，脫氧核酶的濃度越高，RSV蛋白的產(chǎn)量越低（P 0 05）。MTT比色試驗(yàn)顯示，當(dāng)MOI為0 01時(shí)，利巴韋林的最低有效濃度為100μmol /L，是脫氧?
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2002
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

RNA體外轉(zhuǎn)錄流程示意圖過程

圖 1-5 抗 RSV 脫氧核酶在無細(xì)胞系統(tǒng)中對(duì) RSV RNA底物的切割實(shí)驗(yàn),A 為脫氧核酶V 基因組 RNA 底物 NS1/2RNA 切割結(jié)果 B 為脫氧核酶對(duì) RSV M2mRNA 底物 M2RN切割結(jié)果Fig.1-5 Cell free assay of DNAzyme cleavage for RSV RNA substrate , A. DNAzymeavage for RSV NS1/2RNA substrate B. DNAzyme cleavage for RSV M2mRNA substrate由圖 1-5-A 可見 3 個(gè)抗 RSV 基因組 RNA 脫氧核酶均能切割 R1/2RNA 底物 以 DZ604 的作用最強(qiáng) 抗 RSV 基因組 RNA 脫氧核不能切割 RSV M2mRNA 底物 由圖 1-5B 可見 3 個(gè)抗 RSV M2mR氧核酶中 DZ8269 和 DZ8277 能切割 RSV M2mRNA 底物 RSV2UM 2 未顯示底物切割活性 抗 RSV M2mRNA 脫氧核酶不能切割 R1/2RNA 底物

圖 2-2 RSV致 9HTE 細(xì)胞病變效應(yīng)的觀察A 正常 9HTE 細(xì)胞 ×100B H 不同程度的細(xì)胞病變 B G ×100 H×250Fig. 2-2 Cytopathogenic effect(CPE) of 9HTE cells induced by RSV infectionA Normal 9HTE cells ×100B H CPE of 9HTE cells in different extent, B G ×100 H×250圖 3-2脫氧核酶對(duì) RSV 致 9HTE細(xì)胞病變效應(yīng)的影響A 正常 9HTE 細(xì)胞×100A1 RSV 感染的 9HTE細(xì)胞,×100,MOI=10B1 RSV 感染+DZ 處理的9HTE 細(xì)胞×100 MOI=10Fig.3-2The action of DZ on CPE of

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 俞海國(guó);ICAM-1和NF-κB在RSV感染中的作用及10-23型脫氧核酶體外抗RSV效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2003年

本文編號(hào)：2811294