【摘要】： N-甲基-D-門冬氨酸受體(NMDAR，NR)介導(dǎo)的興奮毒性機(jī)制與許多常見(jiàn)的神經(jīng)、精神疾患，如腦出血、腦腫瘤及腦外傷等引起的癲癇、抑郁、癡呆等有密切關(guān)系。已有的NR受體拮抗劑或阻斷劑均為人工合成的小分子藥物，能彌散通過(guò)血腦屏障(空間窗過(guò)大)，作用選擇性低，病變腦區(qū)及非病變腦區(qū)都會(huì)受到影響，而且由于神經(jīng)元可逆性損害的“時(shí)間窗”極短，人們難以適時(shí)使用有效的神經(jīng)保護(hù)藥物，這些均導(dǎo)致已有的藥物難以進(jìn)入臨床。因此，人們開(kāi)始探討新的抑制NR功能的方法，保護(hù)性疫苗和抗體治療在該領(lǐng)域是一種新的探索。本課題主要針對(duì)NR主亞基NR1的抗原性、免疫原性及其抗體對(duì)興奮毒性神經(jīng)元損傷保護(hù)作用進(jìn)行充分的研究論證，為興奮毒性腦損傷免疫干預(yù)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下： 一 NR1激動(dòng)劑結(jié)合區(qū)域片段表位分析 采用生物信息學(xué)方法對(duì)人NMDAR主亞基NR1a上兩個(gè)受體激活相關(guān)多肽片段P1(第一跨膜區(qū)前)、P2片段(第三、四跨膜域之間)的理化特性與抗原性進(jìn)行了分析。用GOLDKEY軟件分別選取公認(rèn)的Hopp等與Kyte等親水性參數(shù)、Jain表面可及性參數(shù)、Karplus-Schulz主鏈柔韌性參數(shù)及welling抗原性參數(shù)對(duì)P1、P2兩個(gè)多肽片段進(jìn)行參數(shù)分析。并采用通用的Prosite程序與Chou-Fasman方法比較分析P1、P2多肽片段的氨基酸位點(diǎn)與二級(jí)結(jié)構(gòu)特征。綜合判定兩個(gè)多肽片段的抗原性及其位點(diǎn)，結(jié)果認(rèn)為P2抗原性強(qiáng)于P1。P2片段可能的抗原位點(diǎn)有7個(gè)，從氨基端開(kāi)始依次是FLVLDRPEERI、RLRNPSDKFIYAT、YRHMEKHNYES、RDNKLHAFIW、ASQKCDLVTT、KDSPWKQNVS、ILKSHENGF，分布較均勻，包含有受體激活相關(guān)重要位點(diǎn)或與其距離較近。與P1相比，P2更容易成為免疫干預(yù)的靶片段。 二M3M4環(huán)靶片段特異性單抗表位分析 為了進(jìn)一步獲得M3M4片段的表位信息，我們以單克隆抗體MAB363(識(shí)別 表位位于人NRI分子M3M4環(huán))淘篩噬菌體展示隨機(jī)12膚庫(kù)，對(duì)篩選克隆進(jìn)行 特異性ELISA檢測(cè)和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析，從30個(gè)克隆中得到一個(gè)陽(yáng)性克隆序列 “VHTN甲sTwQPIL”(克隆1);原核表達(dá)的NRI M3M4環(huán)可以與克隆1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 MAB363;結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果，固相合成5個(gè)表位探針短膚，發(fā)現(xiàn)其中只有 R(22)L RNpsKD可以與M3M4環(huán)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，將NPs三個(gè)氨基酸殘基逐一敲除， 缺失N或NP的合成膚和M3M4環(huán)競(jìng)爭(zhēng)抗體的能力減弱，缺失N甲S的合成膚完全 沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)能力。提示N[PS可能是NRI膜蛋白M3M4環(huán)靶片段上一個(gè)重要的B細(xì) 胞表位(主表位)，其序列或構(gòu)象特征，特別是其中S殘基在原子水平上的某種特 征(另兩個(gè)陽(yáng)性克隆序列均含有SPPL殘基)，可能為生物信息學(xué)預(yù)測(cè)表位 RLRNI〕SD昨工YAT以及噬菌體展示膚vHTNPSTwQPIL的免疫反應(yīng)原性所必需。 三M3 M4片段免疫應(yīng)答檢測(cè)及抗血清的抗興奮毒性作用與機(jī)制探討 (一)M3M4片段免疫應(yīng)答檢測(cè) 為研究M3M4的免疫原性并制備抗血清，M3M4重組膚(100卜g/只)多點(diǎn)注射 免疫Balb/C(H一2‘)小鼠，初次免疫時(shí)加福氏佐劑乳化分別于第4周和第6周 加強(qiáng)。流式細(xì)胞儀測(cè)定脾細(xì)胞CD4+、CDS寸淋巴細(xì)胞亞群，間接ELISA測(cè)定血 清Thl細(xì)胞因子幾一2、TN下一a和『N一Y，Th一2細(xì)胞因子幾一4、IL巧和幾一6的水 平，同時(shí)檢測(cè)特異性抗體產(chǎn)生情況。第6周和第8周CD4+、CDS’T淋巴細(xì)胞的百 分率與對(duì)照組相比都有顯著性的增加(P0.01)尤其是CDS+T淋巴細(xì)胞的百分率 有更明顯的增加，CD4十/C DS‘比值降低。初次免疫后4w+ld血清細(xì)胞因子有顯著變 化，其中TN下一。、IFN一Y、IL一4、幾一6明顯增加，與對(duì)照組之間有顯著性差異， 說(shuō)明小鼠機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生了細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。初次免疫后第5周開(kāi)始可以檢 測(cè)到抗M3M4工gG抗體，以后抗體水平開(kāi)始升高，于第8周達(dá)到高峰，抗血清滴度 為l:100。，抗血清還可以結(jié)合合成膚NPS，證明該表位具有免疫原性和抗原性。 收集抗血清用于功能檢測(cè)。 (二)M3M4片段抗血清抗興奮毒性損害作用 以臺(tái)盼藍(lán)染色法和原位末端標(biāo)記(TUN’EL)法觀察抗血清對(duì)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng) 元興奮毒性壞死和凋亡的保護(hù)效應(yīng)。結(jié)果，在高濃度谷氨酸(500 0 mol/L)條件下， 抗血清可以使神經(jīng)元壞死減少16%;在低濃度谷氨酸(50卜Inol/L)作用下，抗血清 保護(hù)可使神經(jīng)元凋亡率減少13%。說(shuō)明NMDA受體重組膚免疫抗血清具有抗興奮毒 性損傷的作用。以上研究為免疫防治興奮毒性腦損傷策略的建立提供了堅(jiān)實(shí)的體 外實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 (三)單克隆抗體擬B363抗興奮毒性損害作用 琳B363識(shí)別表位位于主亞基NRI重要功能區(qū)附近，為了了解其是否對(duì)興奮毒 性腦損害有保護(hù)作用，通過(guò)檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞存活率(臺(tái)盼藍(lán)拒染法)和細(xì)胞培養(yǎng)上 清乳酸脫氫酶漏出量以及細(xì)胞形態(tài)學(xué)、凋亡率觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.妙mo1/’L的單 抗琳B363可以明顯提高神經(jīng)元抗谷氨酸興奮毒性損傷能力，細(xì)胞存活率提高41%; 乳酸脫氫酶漏出量減少25%;抗體表位合成膚可以阻斷這種保護(hù)，提示該抗體的表 位是一個(gè)受體功能拮抗靶點(diǎn)。 (四)單克隆抗體以B363抗興奮毒作用機(jī)制探討 (1)探討抗體保護(hù)與神經(jīng)元鈣離子內(nèi)流的關(guān)系。通過(guò)激光共聚焦方法來(lái)觀察 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化，結(jié)果，體外培養(yǎng)12天的
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 劉淑紅,孫長(zhǎng)凱,張玉梅,范明,韓大躍,王吉慶,袁博;人NR1靶片段的原核表達(dá)[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2002年03期

2 葉敏;基因工程抗體研究進(jìn)展[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;1996年04期

3 孫長(zhǎng)凱,趙杰,李伍舉,馮健男,劉淑紅,朱克,王吉慶,尹安民,韓大躍,張萬(wàn)琴,姜潮,姜長(zhǎng)斌,聶志余,王耀山,包禮平,范明;人N-甲基-D-門冬氨酸受體主亞基受體激活相關(guān)多肽的理化特性與抗原性分析[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2002年01期

本文編號(hào)：2802235