本文關(guān)鍵詞：ENU誘變巨結(jié)腸小鼠模型的分子機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：乙烷基亞硝基脲(Ethylnitrosourea,ENU)是一種人工合成的能導致多種生物體發(fā)生隨機、單堿基突變的化合物。ENU能不依賴于任何代謝過程,而通過烷化反應將其乙烷基加入DNA堿基的部分基團,從而引起堿基配對錯誤。利用ENU可在較短時間內(nèi)誘導小鼠產(chǎn)生大量隨機突變表型。采用ENU誘變手段,本實驗室篩選獲得了一種顯性遺傳的腹部白斑小鼠,該小鼠突變純合子表現(xiàn)為嚴重花斑表型且出現(xiàn)巨結(jié)腸癥。本研究以該突變系小鼠為研究對象,從以下3個部分開展研究工作： 1ENU誘變獲得一種巨結(jié)腸癥小鼠 通過ENU誘變C57BL/6(B6)雄性小鼠后將其與正常B6雌鼠合籠,在G1代小鼠中篩查發(fā)現(xiàn)了一例腹部白斑表型的小鼠。將其與野生型B6小鼠配種后記錄的25只后代小鼠中,其中9例小鼠表現(xiàn)為腹部白斑表型。將該雜合子小鼠互交獲得42只小鼠,其中12只為花斑表型的突變純合子小鼠,進一步研究發(fā)現(xiàn)突變純合子小鼠表現(xiàn)為腹部腫大,并于出生后數(shù)周死亡。解剖發(fā)現(xiàn),突變純合子小鼠出現(xiàn)嚴重的巨結(jié)腸表型。 2巨結(jié)腸突變基因的定位及鑒定 為了定位該突變基因,將(B6×D2)F1突變雜合子小鼠互交獲得F2代巨結(jié)腸小鼠,提取F2代小鼠的鼠尾DNA,利用微衛(wèi)星對突變小鼠的染色體進行基因組掃描。定位結(jié)果表明在24個樣品中突變基因與微衛(wèi)星D14mit165及D14mi265未發(fā)生一例交換；最終將突變基因定位于微衛(wèi)星D14Mit165與D4Mit265之間(或附近),通過對局部區(qū)域基因功能分析,初步判定Ednrb基因為本突變候選基因。 設計擴增針對Ednrb基因編碼區(qū)引物,對野生型及巨結(jié)腸小鼠腦總RNA進行RT-PCR擴增,產(chǎn)物回收后進行測序比對,結(jié)果顯示B6小鼠編碼區(qū)第865位堿基為T,而巨結(jié)腸小鼠為C,該突變位于Ednrb基因第4號外顯子。氨基酸序列預測表明,該突變引起EDNRB蛋白第286位亮氨酸(L)被脯氨酸(P)所替代(L286P),突變發(fā)生在EDNRB蛋白第5跨膜區(qū)。 3Ednrb (L286P)錯義突變對細胞內(nèi)Ca2+濃度的影響 擴增野生型及突變純合子小鼠Ednrb基因,將其克隆至(?)pCMV-tag2B真核表達載體,分別命名為pCMV-tag2B-WETB、pCMV-tag2B-METB。用脂質(zhì)體2000將以上重組載體轉(zhuǎn)染于CHO-K1細胞,同時設pCMV-tag2B空載體為對照組。轉(zhuǎn)染24～48h左右加入Fluo4-AM孵育30min后采用三個不同濃度ET-3刺激15min,最終通過多功能酶標儀檢測細胞內(nèi)熒光強度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與轉(zhuǎn)染pCMV-tag2B-WETB組相比,轉(zhuǎn)染pCMV-tag2B-METB組細胞內(nèi)Ca2+濃度顯著降低,進一步表明L286P突變可影響EDNRB蛋白功能,是引起巨結(jié)腸表型的主要原因。
【關(guān)鍵詞】：ENU 巨結(jié)腸癥 基因定位 Ednrb基因 Ca~(2+)濃度測定
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R-332;R574.62
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 目錄7-8
• 符號說明8-9
• 第一部分 文獻綜述9-25
• 第一章 ENU誘變及突變基因的定位和克隆9-13
• 1 ENU誘變的基本原理9-10
• 2 誘變及篩查的手段10-11
• 3 突變基因的定位及克隆11
• 4 國內(nèi)外ENU誘變研究進展11-13
• 第二章 先天性巨結(jié)腸癥及其相關(guān)基因13-18
• 1 RET基因14-15
• 2 GDNF15
• 3 SOX1015-16
• 4 PHOX2B基因16
• 5 ZFHX1B基因16-17
• 6 內(nèi)皮素信號通路17-18
• 參考文獻(References)18-25
• 第二部分 實驗內(nèi)容25-53
• 第三章 ENU誘變獲得一例巨結(jié)腸癥小鼠25-33
• 1 材料25-26
• 2 實驗方法26-28
• 3 結(jié)果28-29
• 4 討論29-30
• 參考文獻(References)30-33
• 第四章 巨結(jié)腸突變基因的定位及鑒定33-42
• 1 材料33-34
• 2 實驗方法34-36
• 3 結(jié)果36-38
• 4 討論38-40
• 參考文獻(References)40-42
• 第五章 Ednrb(L286P)錯義突變對細胞內(nèi)Ca~(2+)濃度的影響42-53
• 1 材料42-44
• 2 方法44-48
• 3 結(jié)果48-51
• 4 討論51-52
• 參考文獻(References)52-53
• 致謝53-54
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文目錄54-55

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號：280153