本文關(guān)鍵詞：幽門螺桿菌Tipα蛋白經(jīng)激活NF-κB誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:體外克隆表達(dá)幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白(Tipα),觀察其能否誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子,并初步探討其調(diào)控機(jī)制。方法:從Genebank上查得Hp的Tipα全基因序列,設(shè)計(jì)并合成Tipα序列特異性引物。以Hp基因組為模板,PCR擴(kuò)增獲得Tipα全長基因,經(jīng)雙酶切后與p ET28a載體相連得到重組質(zhì)粒p ET28a-Tipα。經(jīng)PCR、雙酶切和測序鑒定后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21得到重組菌BL21/p ET28a-Tipα,利用IPTG誘導(dǎo)Tipα蛋白表達(dá),以Ni-NTA親和層析法純化獲得Tipα蛋白并利用Western-blot鑒定。培養(yǎng)人單核細(xì)胞系THP-1,用佛波脂誘導(dǎo)其分化為巨噬細(xì)胞后,用0~200μg/ml Tipα刺激24h,100μg/ml Tipα刺激0~36h。ELISA檢測TNF-α,IL-1β和IL-6的分泌情況;實(shí)時(shí)定量PCR檢測TNF-α,IL-1β和IL-6 m RNA表達(dá)。Western blot觀察Tipα處理前后巨噬細(xì)胞中p65蛋白的核轉(zhuǎn)位情況;以NF-κB通路特異性抑制劑PDTC預(yù)孵育細(xì)胞,Tipα刺激后檢測TNF-α,IL-1β和IL-6的分泌水平。結(jié)果:(1)以Hp 26695株基因組為模板擴(kuò)增獲得Tipα全長基因,構(gòu)建得到大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒p ET28a-Tipα,質(zhì)粒經(jīng)PCR、雙酶切和測序鑒定為p ET28a-Tipa載體構(gòu)建成功,編碼的蛋白序列與NCBI上的序列相同;重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)出分子量約25k Da的融合蛋白,用Ni-NTA親和層析純化獲得高純度的目的蛋白;并用Western-blot檢測為His標(biāo)記的目的蛋白。(2)Tipα蛋白以時(shí)間和濃度依賴性方式刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生前炎癥因子。巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平在一定范圍內(nèi)與Tipα蛋白的刺激濃度呈正相關(guān)。在0~24h的作用時(shí)間內(nèi),隨刺激時(shí)間的延長,誘生炎癥因子的水平逐漸升高。TNF-α、IL-1β和IL-6 m RNA的表達(dá)水平與ELISA結(jié)果一致;(3)Tipα刺激巨噬細(xì)胞2h即可檢測到p65亞基轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi),持續(xù)至4h。在此時(shí)間內(nèi),細(xì)胞漿中p65水平逐漸降低;(4)PDTC預(yù)處理巨噬細(xì)胞后可顯著抑制Tipα誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β和IL-6分泌。結(jié)論:幽門螺桿菌Tipα蛋白可能經(jīng)激活NF-κB誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子。
【關(guān)鍵詞】：幽門螺桿菌 腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白 巨噬細(xì)胞 細(xì)胞因子
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R378
【目錄】：

• 主要英文縮略語索引4-5
• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-11
• 實(shí)驗(yàn)材料11-13
• 實(shí)驗(yàn)方法及步驟13-26
• 結(jié)果26-33
• 討論33-36
• 結(jié)論36-37
• 參考文獻(xiàn)37-39
• 文獻(xiàn)綜述39-44
• 參考文獻(xiàn)42-44
• 參與課題與發(fā)表文章44-45
• 致謝45-46
• 附錄1 pET28a-Tipα測序圖46-47

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本文編號(hào)：280149