【摘要】：PSGL-1表達細胞株的建立及其形態(tài)和生物學特性的研究 P選擇素糖蛋白配體1（P Selectin glycoprotein ligand 1，PSGL-1）廣泛分布于免疫細胞表面，在生物體內(nèi)可與P、L、E選擇素結合。在炎癥發(fā)生、發(fā)展中有重要作用。主要表現(xiàn)為免疫細胞上的PSGL-1與炎癥部位血管內(nèi)皮上的P選擇素結合，并可在內(nèi)皮細胞上滾動，最后透過血管壁滲透到炎癥部位。 作者構建了人PSGL-1黑色素瘤細胞系A2058轉染細胞系，實驗結果表明，該轉染細胞系可在體外培養(yǎng)中長期穩(wěn)定表達PSGL-1蛋白。從培養(yǎng)板上分離培養(yǎng)單個生長的PSGL-1轉染細胞克隆，用12孔或24孔板擴大培養(yǎng)。待細胞生長至足夠數(shù)量，取部分細胞以小鼠抗人PSGL-1抗體做WESTERN BLOT 篩選。取PSGL-1高表達細胞做擴大培養(yǎng)。野生型PSGL-1分子由兩個120KD同源雙體通過二硫鍵連接而成，總分子量240KD。用非變性條件電泳，A2058PSGL-1轉染細胞裂解液樣品可見240KD處明顯小鼠抗人PSGL-1抗體陽性雜交帶（附錄一fig 1左圖 ）。用變性條件電泳，A2058PSGL-1轉染細胞裂解液樣品則可見120KD處明顯小鼠抗人PSGL-1抗體陽性雜交帶。對照A2058pCDNA3轉染細胞裂解液樣品無PSGL-1抗體陽性雜交帶。小鼠抗人PSGL-1抗體免疫組織化學染色可見細胞表面棕黃色陽性染色。對照的載體轉染細胞呈陰性染色（見附錄一fig 2） 與轉染pCDNA3載體 A2058細胞系相比，在形態(tài)學方面，轉染PSGL-1后的細胞形態(tài)改變較大，由轉染前細胞較長、形態(tài)伸展變?yōu)?WP=58 轉染后細胞較短、較不伸展，免疫細胞化學染色也顯示了同樣的結果；低密度培養(yǎng)的PSGL-1轉染細胞，生長細胞呈三角形伸展狀態(tài)。與pDNA3載體轉染A2058細胞或未轉染A2058細胞系相比胞體較小。（見附錄一fig 3、4右圖）高密度培養(yǎng)細胞鏡下可見單個細胞形態(tài)同細胞低密度培養(yǎng)形態(tài)。生長細胞間彼此沒有覆蓋。接觸的細胞間有明顯邊界，接觸緊密。（見附錄一fig5右圖）而低密度培養(yǎng)的正常A2058細胞和轉染pCDNA3載體 A2058細胞系，生長細胞呈梭形或長梭形伸展狀態(tài)。（見附錄一fig3左圖，中圖。fig4左圖，中圖）高密度培養(yǎng)細胞，鏡下可見單個細胞形態(tài)同細胞低密度培養(yǎng)形態(tài)。生長細胞可彼此覆蓋，生長方式紊亂。接觸的細胞間沒有邊界。將A2058 PSGL-1轉染細胞與載體轉染細胞混合培養(yǎng)，觀察在相同培養(yǎng)條件下兩者生長形態(tài)是否有差別。小鼠抗人PSGL-1抗體免疫組織化學染色可見三角形棕黃色陽性染色細胞和梭形陰性染色細胞。（見附錄一fig 6） 在細胞黏附性方面，把A2058 PSGL-1轉染細胞與載體轉染細胞對蛋白聚糖聚合物Versican G3片段及Fibronectin黏附能力相比較比較表明，A2058 PSGL-1轉染細胞對培養(yǎng)板中G3片段及Fibronectin包被的區(qū)域有特異性黏附，而載體轉染細胞沒有這種特異性黏附。（附錄一fig9） A2058 PSGL-1轉染細胞遷移能力與載體轉染細胞相比明顯減弱。在18小時組、24小時組，載體轉染細胞遷移到空白區(qū)的細胞數(shù)量明顯高于A2058 PSGL-1轉染細胞。（附錄一fig11，fig12,fig13） Western Blot 分析結果表明，兩種細胞在以下蛋白分子的表達上沒有區(qū)別：整合素β1、整合素α5、α3、Syk、整合素αv ,E-Cadherin、collagen 1。（附錄一fig14，fig15,fig17） A2058 PSGL-1轉染細胞與載體轉染細胞相比較表達水平升高的蛋白分子有：N-Cadherin, β-catenin （附錄一fig17） WP=59 用免疫熒光染色比較兩種細胞ACTIN表達水平，兩種細胞ACTIN表達水平?jīng)]有明顯差別。（fig18） 作者構建的PSGL-1 A2058表達細胞株，可在體外培養(yǎng)中長期穩(wěn)定地表達PSGL-1蛋白，凍存復蘇后培養(yǎng)，其表達水平不受影響。我們在完成陽性細胞克隆篩選后，繼續(xù)用篩選時的藥物濃度（1000ug/ml G418）培養(yǎng)細胞，而不按照常規(guī)操作將藥物篩選濃度減半，可能是使細胞一直保持轉染蛋白長期穩(wěn)定表達的原因之一。 有文獻報道，細胞表面表達的PSGL-1分子和細胞的微管、微絲相關，而微管、微絲和細胞的形態(tài)學關系密切。 在實驗中我們發(fā)現(xiàn)，轉染PSGL-1的細胞形態(tài)學和未轉染細胞及轉染空載體的細胞相比，細胞由伸展較大的梭形變?yōu)樯煺馆^小的三角形。 PSGL-1對細胞形態(tài)學的影響有兩種可能途徑：一是直接影響，既PSGL-1本身即是形態(tài)相關分子，其在細胞膜上的表達與否直接影響細胞形態(tài)。我們構建了特異性SiRNA，用以封閉PSGL-1在小鼠巨噬細胞系SAW273.1中的表達，觀察細胞形態(tài)是否發(fā)生變化。目前實驗尚未完成。有文獻報道,白細胞中PSGL-1細胞漿功能區(qū)可通過Syk蛋白與actin連接蛋白(moesin,ezrin)相聯(lián)接，(Ana,U.,M.S.Juan.2002)。我們考慮是否PSGL-1轉染細胞是否上調(diào)sky表達進而影響到actin表達，后者使細胞形態(tài)發(fā)生變化.試驗結果表明,Syk蛋白在兩種細胞中的表達沒有差別. PSGL-1對細胞形態(tài)學的影響另一個途徑是間接途徑，細胞表達PSGL-1后對其他分子的表達水平產(chǎn)生影響，后者使細胞形態(tài)學發(fā)生變化。在實驗中我們發(fā)現(xiàn)，PSGL-1轉染細胞N-Cardherin 表達水平升高。N-Cardherin分子可通過β-catenin連接actin,此三者和細胞間的連接、細胞的結構和形態(tài)關系密切（Margaret,J.2003)。Western blot結果也表明, β-catenin在PSGL-1轉染細胞中表達顯著升高.但在兩種細胞中actin表達水平?jīng)]有明顯差別,因此，細胞
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R392
【圖文】：

吉林大學博士學位論文氨基酸轉換酶切割。成熟蛋白的細胞外區(qū)開始于第 42 個氨基酸，有許多粘蛋白的特征。它富含絲氨酸、纈氨酸、脯氨酸，還包括 15 個10 個氨基酸一組的重復序列。三個 N 末端的 46、48、51 位酪氨酸位于一段陰離子序列中，使其易于發(fā)生酪氨酸磷酸化。一個單個的細胞外半胱氨酸連接到跨膜區(qū)，跨膜區(qū)之后是一個由 69 個氨基酸組成的胞漿區(qū)。小鼠的 PSGL-1 分子量大小和人的相似，同樣也有一個信號肽、前導肽、靠近跨膜區(qū)的單個半胱氨酸，但其 N末端只有兩個酪氨

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