本文關(guān)鍵詞：抗諾如病毒雞卵黃抗體的制備及其初步應(yīng)用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景： 諾如病毒(Norovirus, Nov)與札幌樣病毒(Sapporolike Virus, SLV)合稱為人類杯狀病毒(Calicivirus)。該病毒是于1972年,由Kapikian在1968年美國Norwalk地區(qū)暴發(fā)的急性胃腸炎患者的糞便中采用免疫電鏡法檢測(cè)出來的球狀病毒顆粒,直徑在27-32nm之間。如今,Nov已成為非細(xì)菌性急性胃腸炎的主要病原體�？稍谟變簣@、夏令營、學(xué)校、醫(yī)院、養(yǎng)老院、餐館、部隊(duì)(航海艦隊(duì))與游船等小型單位引起暴發(fā),所有年齡段均可被感染。對(duì)新世紀(jì)多次暴發(fā)的腹瀉病原分析發(fā)現(xiàn),G Ⅱ型Nov已成為全球病毒性胃腸炎最常見的Nov病毒株,其中GⅡ.4型Nov毒株占主導(dǎo)地位。目前主要采用RT-PCR法檢測(cè)食物、糞便和水中的Nov,此法敏感性較高、重復(fù)性好,但耗時(shí)較長,儀器設(shè)備要求較高。且由于毒株的多樣性,RT-PCR必須要使用混合引物。如今,RT-PCR已逐漸被熒光定量PCR取代,后者更加快速和靈敏,特別是使用Taqman探針時(shí),單次試驗(yàn)即可提供證據(jù)并進(jìn)行定量檢測(cè),但此法儀器設(shè)備要求高,很難在現(xiàn)場(chǎng)和基層普及。 禽類血液中的抗體IgG可轉(zhuǎn)移到卵黃液中,并在胚胎發(fā)育過程中對(duì)潛在的各種病原體感染起到被動(dòng)保護(hù)作用,這種抗體稱為卵黃抗體即IgY。IgY是存在于禽蛋卵黃中的主要抗體,屬多克隆抗體,在疾病診斷和防治的應(yīng)用方面有許多優(yōu)點(diǎn)。通過免疫血清的途徑一次性制備大量抗體是相當(dāng)困難的,且多次制備會(huì)導(dǎo)致抗體的均一性差。產(chǎn)蛋雞經(jīng)免疫后,可從其卵黃不斷獲得特異性抗體。IgY具有特異性強(qiáng)、純度高等優(yōu)點(diǎn),不會(huì)與哺乳動(dòng)物產(chǎn)生過敏反應(yīng)或交叉血清反應(yīng),可替代通過免疫兔、小鼠等哺乳動(dòng)物而進(jìn)行抗體的大量生產(chǎn)。近年來,IgY的研究和應(yīng)用已經(jīng)成為免疫學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。Woolley等用重組人白細(xì)胞介素-6分別對(duì)羊和雞進(jìn)行免疫,制備了IgG和IgY,發(fā)現(xiàn)兩者對(duì)人白細(xì)胞介素-6都有很高的親和力,表明IgY可以代替哺乳動(dòng)物的IgG進(jìn)行免疫檢測(cè)。2003年,de-Almeida CM制備了抗BfpA IgY應(yīng)用于免疫吸附,發(fā)現(xiàn)其可以特異性地鑒定EPEC。Ohnishi T等用IgY與IgG進(jìn)行ELISA檢測(cè)HGF,發(fā)現(xiàn)IgY使靈敏度提高了10倍,不但能檢測(cè)出血中的HGF,還能檢測(cè)正常人尿中的HGF。Juliarena等表達(dá)了GST-p24融合蛋白,再以此免疫蛋雞制備了特異性IgY用于免疫診斷。結(jié)果表明用IgY檢測(cè)可避免常規(guī)的哺乳動(dòng)物二抗所帶來的交叉反應(yīng)。IgY作為檢測(cè)試劑用于一系列的分析技術(shù),將有望更多的應(yīng)用于診斷試劑的領(lǐng)域,在診斷試劑的開發(fā)中發(fā)揮重要作用。 本研究用GⅡ.4型387型菌株Nov P顆粒蛋白抗原作為抗原免疫產(chǎn)蛋來航雞制備抗Nov卵黃抗體IgY,在此基礎(chǔ)上對(duì)IgY進(jìn)行HRP酶標(biāo)制備酶標(biāo)抗體,建立用于檢測(cè)Nov的雙抗體夾心ELISA體系,并進(jìn)行評(píng)價(jià)。為IgY今后在診斷和疾病防治方面的應(yīng)用奠定一定基礎(chǔ),并為Nov的檢測(cè)和防治提供新的思路。 研究目的和內(nèi)容 1.制備特異性抗Nov卵黃抗體IgY。 2.研究特異性抗Nov卵黃抗體IgY的特性。 3.利用特異性抗Nov卵黃抗體IgY建立雙抗體夾心ELISA體系用于Nov的檢測(cè),并對(duì)其進(jìn)行初步應(yīng)用評(píng)價(jià)。 方法： 1.抗Nov雞卵黃抗體IgY的制備 (1)采用GⅡ.4型387型菌株Nov P顆粒蛋白抗原與等量弗氏佐劑乳化制備免疫制劑,采用多次多點(diǎn)雙翅下肌肉注射的方式免疫產(chǎn)蛋來航雞； (2)收集免疫前一周及免疫后三個(gè)月內(nèi)的雞蛋； (3)改良水稀釋法和硫酸銨兩次分級(jí)沉淀法(終飽和度分別為55%和33%)分離、純化雞卵黃抗體； (4)間接ELISA法檢測(cè)雞IgY各周期的效價(jià)變化； (5) SDS-PAGE電泳鑒定雞IgY的純度,Western blot法鑒定雞IgY的特異性； (6)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定雞卵黃抗體中的總蛋白含量； (7)將卵黃抗體溶液稀釋成不同濃度置于25℃室溫環(huán)境下評(píng)價(jià)其室溫穩(wěn)定性；在不同pH環(huán)境下作用評(píng)價(jià)其pH穩(wěn)定性；在不同溫度下處理評(píng)價(jià)其熱穩(wěn)定性；將其用不同pH環(huán)境的胃蛋白酶進(jìn)行處理,評(píng)價(jià)胃蛋白酶對(duì)雞卵黃抗體的影響；在-20℃與4℃環(huán)境下反復(fù)凍融5次,評(píng)價(jià)反復(fù)凍融對(duì)其的影響。 2.基于抗Nov雞卵黃抗體的ELISA檢測(cè)體系的建立及評(píng)價(jià) (1)采用過碘酸鈉法對(duì)抗Nov雞卵黃抗體IgY進(jìn)行酶標(biāo)制備酶標(biāo)抗體; (2)采用280nm下的紫外吸收法測(cè)定酶標(biāo)抗體的蛋白含量,并計(jì)算其標(biāo)記率、克分子比值； (3)利用上述獲得的酶標(biāo)抗體建立雙抗體夾心ELISA檢測(cè)體系； (4)對(duì)所建立的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)體系的各個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化； (5)評(píng)價(jià)所建立的雙抗體夾心ELISA體系的最低檢出限、與輪狀病毒和腺病毒的交叉反應(yīng)、批內(nèi)變異系數(shù)及批間變異系數(shù)； (6)將所建立的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)體系與金標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR加測(cè)序法比較,對(duì)其進(jìn)行臨床應(yīng)用評(píng)價(jià),計(jì)算靈敏度、特異度及約登指數(shù)。 結(jié)果： 1.抗諾如病毒雞卵黃抗體IgY的制備 (1)改良水稀釋法加硫酸銨兩次分級(jí)沉淀法分離、純化的抗Nov雞卵黃抗體的效價(jià)在第一次加強(qiáng)免疫后迅速上升,到首次免疫后的第五周效價(jià)達(dá)到最高為1：51200,后慢慢下降穩(wěn)定至1：12800。 (2) SDS-PAGE結(jié)果顯示純度較好,條帶主要集中在66KDa和33KDa左右,雜帶較少。Western blot結(jié)果顯示所制備的雞卵黃抗體IgY可與GⅡ.4型387型菌株Nov P顆粒蛋白抗原發(fā)生特異性結(jié)合。 (3)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得雞卵黃抗體IgY溶液的總蛋白含量為7.2mg/ml蛋黃液。 (4)理化性質(zhì)評(píng)價(jià)結(jié)果為不同稀釋梯度的雞卵黃抗體在25℃室溫下保存三個(gè)月,IgY效價(jià)略有下降,但依然可保持較高活性。在60℃及以下的溫度環(huán)境處理30min后,抗體活性變化不大；在70℃環(huán)境溫度處理30min時(shí),活性稍有下降；IgY抗體在80℃環(huán)境下處理30min后,活性基本消失。雞卵黃抗體IgY在pH3-12范圍內(nèi)活性基本不受影響,而當(dāng)pH值≤2或≥12時(shí)抗體活性快速下降。IgY抗體在pH≥3的胃蛋白酶作用下,活性稍有下降,在pH≤2的胃蛋白酶作用下,活性消失。IgY抗體在-20℃與4℃之間反復(fù)凍融后,活性稍有下降,但幅度較小。 2.基于抗諾如病毒雞卵黃抗體的ELISA檢測(cè)體系的建立及評(píng)價(jià) (1)制得的HRP酶標(biāo)IgY抗體克分子比為1.74,標(biāo)記率為48.73%。蛋白含量為8.58606mg/ml。 (2)對(duì)所建立雙抗體夾心ELISA體系的各個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化得最佳包被稀釋度和最佳酶標(biāo)抗體稀釋度均為1：80,最優(yōu)封閉液為2%BSA,封閉時(shí)間為1小時(shí),最佳酶標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)間為30min,最佳底物作用時(shí)間為15min。 (3)對(duì)所建立雙抗體夾心ELISA體系進(jìn)行評(píng)價(jià)得最低檢測(cè)限為20ng/ml,批內(nèi)變異系數(shù)為1.021%,批間變異系數(shù)為1.150%,與輪狀病毒和腺病毒之間存在反應(yīng)率較低的交叉反應(yīng)。 (4)所建立的雙抗體夾心ELISA體系與金標(biāo)準(zhǔn)相比,檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.6290.05),吻合系數(shù)Kappa=0.637, P=0.000,吻合度一般。臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)計(jì)算得靈敏度為82.50%,特異度為81.82%,約登指數(shù)為0.6432。 結(jié)論： 1.以G Ⅱ.4型387型菌株諾如病毒P顆粒蛋白抗原多次多點(diǎn)免疫產(chǎn)蛋來航雞,成功制備了抗諾如病毒的卵黃抗體IgY,效價(jià)最高可達(dá)1：51200。 2. SDS-PAGE電泳顯示,卵黃抗體純度較高,雜帶較少,電泳條帶主要集中在66KDa和33KDa處,Western blot顯示IgY對(duì)蛋白抗原的特異性較好。 3.改良水稀釋法加硫酸銨兩步分級(jí)沉淀法分離、純化雞蛋黃中的抗Nov特異性IgY,具有簡(jiǎn)便、快捷、高效的優(yōu)點(diǎn),制得的IgY抗體活性較高,適合于IgY的大規(guī)模提取。 4.獲得的IgY抗體對(duì)溫度、酸堿度的穩(wěn)定性較好,在室溫下穩(wěn)定。在胃蛋白酶作用下或反復(fù)凍融,活性稍有下降。 5.用HRP標(biāo)記卵黃抗體IgY,成功制備了以IgY為基礎(chǔ)的酶標(biāo)抗體。 6.以特異性抗Nov抗體IgY作為包被抗體,以酶標(biāo)抗體為捕獲抗體,建立了用于檢測(cè)Nov的雙抗體夾心ELISA體系。對(duì)其條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果如下： (1)包被抗體與捕獲抗體的最佳工作稀釋濃度均為1：80。 (2)封閉液選�。�2%BSA,封閉時(shí)間：1小時(shí)。 (3)酶標(biāo)抗體最佳反應(yīng)時(shí)間：30分鐘。 (4)底物最佳作用時(shí)間：15分鐘。 7.所建立雙抗體ELISA檢測(cè)體系最低檢測(cè)限為20ng/ml,批內(nèi)變異系數(shù)為1.021%,批間變異系數(shù)為1.150%,與輪狀病毒和腺病毒之間存在反應(yīng)率較低的交叉反應(yīng)。 8.與金標(biāo)準(zhǔn)相比,檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,Kappa=0.637。臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)計(jì)算得靈敏度為82.50%,特異度為81.82%,約登指數(shù)為0.6432。
【關(guān)鍵詞】：諾如病毒 卵黃抗體 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 理化性質(zhì)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-28
• 1. 諾如病毒研究現(xiàn)狀16-22
• 2. 卵黃抗體IgY的研究現(xiàn)狀22-27
• 3. 課題研究的目的意義27-28
• 第一章 抗諾如病毒雞卵黃抗體的制備28-49
• 1. 材料28-32
• 2. 方法32-40
• 3. 結(jié)果40-45
• 4. 討論45-48
• 5. 小結(jié)48-49
• 第二章 抗諾如病毒雞卵黃抗體ELISA檢測(cè)方法的建立49-71
• 1. 材料49-51
• 2. 方法51-56
• 3. 結(jié)果56-66
• 4. 討論66-69
• 5 小結(jié)69-71
• 全文小結(jié)71-72
• 參考文獻(xiàn)72-85
• 碩士期間論文發(fā)表情況85-86
• 附錄86-87
• 致謝87-88

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本文編號(hào)：279402