本文關鍵詞：補體C5a及其受體拮抗劑在阿爾茨海默病小膠質(zhì)細胞病變模型中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)以進行性認知功能障礙和神經(jīng)元病理性丟失為特征,是當今世界老齡化趨勢下出現(xiàn)的主要神經(jīng)變性疾病之一。與AD病因機制相關的假說較多,如Aβ毒性學說、Tau蛋白假說、炎癥機制、自由基損傷學說、膽堿能學說等等,盡管眾說紛紜,但Aβ毒性學說仍是目前的主流學說。AD主要是由于Aβ(β-amyloid protein)沉積形成的老年斑與高度磷酸化Tau蛋白聚集形成造成神經(jīng)纖維纏繞和神經(jīng)元丟失。在神經(jīng)變性疾病的相關研究中發(fā)現(xiàn),Aβ以寡聚體或纖維體兩種狀態(tài)存在,這兩種狀態(tài)的Aβ對神經(jīng)細胞功能損傷的強度不同,一般認為,Aβ寡聚體的毒性較纖維體更強,但由于寡聚體的穩(wěn)定性較差,易向纖維體轉化,體外研究操作時間窗相對較短,所以使用寡聚體進行實驗之前,對其進行鑒定就顯得尤為重要,否則容易導致試驗藥物有效的假陽性結果,但目前關于Aβ聚集狀態(tài)的鑒定方法報道較少。為此,本實驗先制備不同聚集狀態(tài)的Aβ1-42,然后通過原子力顯微鏡直觀比較、鑒定兩種Aβ1-42形態(tài)。在AD病理過程中,由于Aβ產(chǎn)生和清除的動態(tài)失衡,過多的Aβ聚集沉積形成老年斑,在AD老年斑周圍聚集了大量活化的小膠質(zhì)細胞,Aβ可促進小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生如TNF-α、IL-1β等炎癥因子,從而對神經(jīng)元在內(nèi)的各種細胞造成損失甚至凋亡,本實驗通過體外建立AD小膠質(zhì)細胞模型,為AD的炎性機制研究提供體外實驗依據(jù)。 已有研究發(fā)現(xiàn),補體系統(tǒng)在阿爾茨海默病的炎性發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。Aβ、小膠質(zhì)細胞、星形細胞及異常上調(diào)表達的補體和細胞因子共同形成了復雜的炎性損傷網(wǎng)絡,引起一系列炎癥反應,最終導致神經(jīng)細胞凋亡,補體系統(tǒng)介導的損害是Aβ細胞毒性作用機制中的重要環(huán)節(jié)之一,Aβ與經(jīng)典補體激活通路的Clq發(fā)生特異性結合,C1q經(jīng)Aβ的激活而活化,活化的Clq隨之活化C3、C4、C5因子,并使補體裂解生成多種生物活性片段,包括C3a、C4a、C5a,最終形成膜攻擊復合物(MAC,C5b-9復合體),具有神經(jīng)毒性的MAC可直接溶解神經(jīng)元,在AD腦內(nèi)造成神經(jīng)元凋亡。其中,補體系統(tǒng)的C5a在AD致病過程中的作用不詳,最近研究發(fā)現(xiàn),在C3基因敲除(C3-/-)小鼠中,IgG免疫復合物依然能夠對小鼠產(chǎn)生C5a依賴的急性肺損傷,且損傷強度與野生型小鼠(C3+/+)的作用相當,這說明C5a的產(chǎn)生可以是非C3依賴性的,這是一條嶄新的補體激活途徑,同時提示,C5a的產(chǎn)生同樣會產(chǎn)生類似補體系統(tǒng)經(jīng)傳統(tǒng)途徑激活后所導致的炎癥損傷作用。C5a可吸引表達C5a受體的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞向活化部位聚集,然后與Aβ發(fā)揮協(xié)同作用,刺激膠質(zhì)細胞產(chǎn)生細胞因子、趨化因子、黏附分子等,也可直接與小膠質(zhì)細胞結合誘發(fā)氧化應激反應,導致鄰近的神經(jīng)細胞損傷或死亡。因此,本研究將驗證補體C5a對AD小膠質(zhì)細胞激活、炎性介質(zhì)釋放的可能作用及其機制,并進一步明確C5a受體拮抗劑PMX205對上述病變過程的干預作用。 [目的] 建立A β1-42寡聚體和纖維體的制備及其鑒定方法,利用Aβ1-42寡聚體刺激小膠質(zhì)細胞建立阿爾茨海默病(AD)小膠質(zhì)細胞病變模型；在此基礎上,探討補體C5a對AD小膠質(zhì)細胞模型釋放炎性因子的作用及其機制,明確C5a受體拮抗劑對上述病變過程的干預作用。 [材料和方法] 1材料：小鼠BV2小膠質(zhì)細胞株購自武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心,澳洲胎牛血清(GIBCO),DMEM/F12高糖培養(yǎng)基(GIBCO),胰酶(含EDTA,0.25%,吉泰生化公司),人工合成的生物晶體Aβ1-42(ENZO公司),六氟異丙醇(HFIP,Sigma),二甲基亞砜(DMSO,MP Biomedicats),補體C5a(HBT公司),C5a受體拮抗劑(PMX205) hydrocinnamate-[OP(D-Cha)WR](上海吉爾生化有限公司合成),PE標記的抗小鼠CD88流式抗體(Bio legend公司),小鼠TNF-a ELLSA試劑盒(Bio legend公司),CCK-8試劑盒(日本同仁公司)。 儀器：超凈工作臺(中國,AIRTECH),細胞培養(yǎng)箱(美國,Thermo Foma)、倒置顯微鏡(日本,OLYMAPUS)、流式細胞分析儀(德國,Becton Dickinson),低溫高速離心機(德國,Beckman), SynerTM HT多通道酶標儀(美國,BIOTEK),原子力顯微鏡(本原納米儀器公司,型號CSPM5500)。 2方法： 2.1BV-2細胞培養(yǎng)將BV-2細胞株接種到含10%胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),置于37�！�、5%C02培養(yǎng)箱中孵育,每3天傳代一次,用0.25%胰酶+0.02%EDTA消化。 2.2設定不同的環(huán)境條件將A β1-42單體分別聚集成寡聚體和纖維體兩種狀態(tài)將lmg Aβ1-42粉末溶于冷卻的六氟異丙醇(HFIP)220μL中,室溫孵育60分鐘使Aβ1-42充分溶解,將Aβ肽-HFIP放置在冰上5～10分鐘后移至通風櫥內(nèi),打開瓶蓋以便HFIP揮發(fā)。風干后形成透明的Aβ肽膜,溶解于44μL新鮮無水100%DMSO制成5mmol/LA β1-42合成肽,用無含酚紅的F12培養(yǎng)液稀釋成終濃度50nmol/L,4℃孵育24小時后,以4℃,14000r/min離心10分鐘,取上清液即為Aβ1-42寡聚體,放置在-80℃保存。將5mmol/L Aβ1-42-DMSO合成肽用10mmo/L鹽酸溶解稀釋成終濃度50nmol/L,置于37℃溫箱孵育24小時即為Aβ1-42纖維體,放置在-80℃保存。 2.3利用原子力顯微鏡鑒定Aβ1-42的不同聚集狀態(tài)。原子力顯微鏡鑒定方法：將A β1-42制成品滴于新鮮解離的云母片上,室溫下靜置5分鐘后用去離子水輕柔沖洗,干燥皿中干燥10分鐘后放置在原子力顯微鏡下觀察,先用接觸模式掃描到云母片上的生物制品,再改用輕敲模式進行掃描。輕敲模式參數(shù)：力常數(shù)40N/m,共振頻率300kHz,掃描頻率1Hz。圖像處理軟件為Imager4.60。 2.4利用CCK-8法比較A β1-42寡聚體與纖維體對BV-2細胞存活率的影響。以細胞密度為105/ml的BV-2小膠質(zhì)細胞接種于96孔板,加入無血清DMEM/F12高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時,然后分別加入不同濃度(0.01um/L,0.1um/L, lum/L,10um/L) Aβ42寡聚體和纖維體,共同作用24小時后吸除上清液,每孔加入180ul培養(yǎng)基L+20ul CCK-8試劑避光共同孵育,待2小時后通過酶標儀測定450nm波長處OD值。重復3次。 2.5用Aβl-42寡聚體刺激BV-2小膠質(zhì)細胞建立AD小膠質(zhì)細胞病變模型。實驗組分為Aβ1-42干預組、Aβ1-42+C5a組、Aβ1-42+C5aRA組、Aβ1-42+C5a+C5aRA組,分別加入不同濃度的C5a、C5aRA、 C5a+C5aRA進行干預,以BV-2小膠質(zhì)細胞無干預組為空白對照。 2.6ELISA法檢測細胞上清中TNF-a水平經(jīng)不同干預處理24小時后,取細胞上清液,按照試劑盒說明書進行ELISA檢測上清液中TNF-a含量,波長設定為450nm,以96孔酶標儀檢測吸光度值,通過標準品對數(shù)曲線計算出TNF-a含量。 2.7流式細胞術檢測細胞表面CD88表達經(jīng)處理24小時后,將不同處理組細胞消化、重懸成單細胞懸液,每組細胞加入PE標記的抗小鼠CD88抗體進行染色,4℃孵育30分鐘,用PBS清洗細胞3次,流式細胞儀檢測CD88表達。 3統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學處理,實驗結果以x±sd表示,BV-2細胞經(jīng)同一濃度水平、不同狀態(tài)的Aβ1-42干預后的存活率比較方法采用獨立樣本t檢驗,補體C5a干預實驗中兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較先采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),如有統(tǒng)計學意義差別時,再采用LSD法進行兩兩比較,以P0.05為有效統(tǒng)計學差異水平。 [結果] 1在原子力顯微鏡下,Aβ1-42寡聚體呈球狀或橢圓球狀顆粒,高度為5nm左右,而Aβ1-42纖維體在鏡下則呈現(xiàn)長條纖維狀聚集,高度約為3nm左右,長度1000nm。 2CCK8法顯示無論Aβ1-42寡聚體和纖維體均對BV-2細胞具有損傷作用,并且成劑量-效應關系,同時,在同樣濃度水平的條件下,自0.1um/L濃度起,寡聚體的毒性作用均比纖維體更顯著(所有P值均小于0.05) 3Aβl-42寡聚體能刺激BV-2小膠質(zhì)細胞分泌TNF-a,Aβ1-42組TNF-a濃度與空白對照組相比明顯增加(t=16.60,P0.05),該組CD88表達高于空白對照組(t=4.81,P0.01)；Aβ1-42+C5a組的TNF-a濃度高于單純Aβl-42組(F=24.50,P0.05),Aβ1-42+C5aRA組TNF-α濃度低于單純Aβ1-42組(F=280.12,P0.01),發(fā)現(xiàn)50nmol/L C5aRA可顯著抑制5nmol/L C5a對AD小膠質(zhì)細胞TNF-α的釋放作用(t=28.06,P0.01),100nmol/L C5aRA可顯著抑制10nmol/L C5a對AD小膠質(zhì)細胞TNF-a的釋放作用(t=5.73,P0.01)。而Aβ1-42+C5a組及Aβ1-42+C5aRA組的CD88表達與單純Aβ1-42組相比無顯著差異(P0.05)。 [結論] 原子力顯微鏡可直觀地觀察到Aβ1-42的不同聚集狀態(tài),是鑒別A B1-42寡聚體與纖維體的簡便、直觀的方法,Aβ2-42寡聚體比纖維體更具細胞毒性；C5a能刺激小膠質(zhì)細胞分泌炎癥因子TNF-a,且與Aβ1-42有協(xié)同作用,而C5aRA則能有效抑制該致病通路。
【關鍵詞】：阿爾茨海默病 補體 β-淀粉樣蛋白 小膠質(zhì)細胞
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R-332;R749.16
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-26
• 第一章 Aβ1-42寡聚體與纖維體的制備及其神經(jīng)毒性26-38
• 一、材料與方法26-31
• 二、結果31-34
• 三、討論34-38
• 第二章 C5a及其受體拮抗劑在AD小膠質(zhì)細胞病變模型中的作用38-51
• 一、材料與方法39-43
• 二、結果43-47
• 三、討論47-51
• 參考文獻51-55
• 綜述55-62
• 參考文獻59-62
• 縮略詞表62-63
• 攻讀學位期間成果63-64
• 致謝64-66
• 附件66

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