【摘要】：乙型肝炎病毒感染是全球性公共衛(wèi)生問題,現(xiàn)有3.5 億患者受其困擾,能和乙肝病毒表面特異性位點(diǎn)結(jié)合并封閉其侵襲肝細(xì)胞活性的單克隆抗體和抗體片段是唯一能用于緊急預(yù)防的生物制品。本文在前期工作的基礎(chǔ)上,將篩選到的抗HBsAg Fab 片段改造成單鏈抗體(single-chain Fv against HBsAg, HBscFv),分別在大腸桿菌和巴氏畢赤酵母中表達(dá),并對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化及體內(nèi)外生物學(xué)活性和理化性質(zhì)鑒定。 采用基因重疊延伸拼接法構(gòu)建抗HBsAg 單鏈抗體基因,測序確認(rèn)后,亞克隆至原核表達(dá)載體pQE-40,獲得表達(dá)質(zhì)粒pQE-HBscFv,并轉(zhuǎn)入宿主菌E.coli M15[pREP4],獲得工程菌M15[pQE-HBscFv];工程菌經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后,合成大量重組HBscFv,其含量可達(dá)菌體總蛋白的31.2%;進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明,重組HBscFv主要以包涵體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中;將表達(dá)質(zhì)粒pQE-HBscFv 轉(zhuǎn)化有利于二硫鍵形成的氧化還原系統(tǒng)缺陷型宿主菌E. coli Origami(DE3),產(chǎn)物仍為包涵體;對包涵體進(jìn)行簡單復(fù)性后測定復(fù)性產(chǎn)物活性,結(jié)果表明,重組HBscFv 具有特異性結(jié)合HBsAg 活性。 對大腸桿菌表達(dá)的HBscFv 包涵體進(jìn)行純化和復(fù)性。優(yōu)化條件誘導(dǎo)HBscFv表達(dá),獲得的包涵體采用4 種方案分別進(jìn)行純化,發(fā)現(xiàn)以IMAC 一步法純化可得純度超過85%的HBscFv,IMAC/GF 組合方案可得純度超過97%的蛋白;對純化的包涵體采用多種方法復(fù)性,發(fā)現(xiàn)透析法比稀釋法或?qū)游鲋粡?fù)性法效率更高,在透析復(fù)性法中,鹽酸胍透析復(fù)性法比尿素透析復(fù)性法效率要高;在最優(yōu)的復(fù)性條件下,蛋白回收率為(61.08±1.45)%,相對比活性為(2.66±0.13) A450/630 U/μg;在搖瓶培養(yǎng)階段,重組HBscFv 的純化產(chǎn)量為34.7 mg/L。 對重組HBscFv 的生物學(xué)活性和理化性質(zhì)進(jìn)行鑒定。非競爭酶免疫法親和常數(shù)測定結(jié)果表明,HBscFv 是中等親和力抗體,親和常數(shù)為(2.30±0.32)×107 M-1;利用轉(zhuǎn)基因小鼠測定重組HBscFv 在體內(nèi)的中和活性,發(fā)現(xiàn)重組HBscFv 具有體內(nèi)中和活性,中和效價為31.58 U/mg。應(yīng)用MALDI-TOF MS 測定HBscFv 分子量,發(fā)現(xiàn)HBscFv 分子量為27314Da,與理論值相差只有8Da;對HBscFv 進(jìn)行肽質(zhì)量酶譜分析,結(jié)果在質(zhì)譜圖上找到超過60%的酶解片段,并且包含N 末端的5 個連
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號】：R392
【圖文】：

人源化抗體結(jié)構(gòu)示意圖

單鏈抗體衍生物的種類較多，可以是多價抗體，也可以是多特異性抗體[148]，它們的結(jié)構(gòu)示于圖1-2 中。相對于全抗體來說，小分子抗體在臨床應(yīng)用上更有優(yōu)勢，它們對實(shí)體瘤的穿透力強(qiáng)、血清廓清速度高，并可通過各種展示文庫表達(dá)。通過與金屬蛋白、毒素或藥物等活性物質(zhì)融合，小分子抗體可以獲得新的活性。這在活體影像診斷方面有廣闊前景，放射性標(biāo)記的單鏈抗體已成功用于腫瘤的顯影[105]；此外，小分子抗體還可以構(gòu)建成雙特異性抗體或雙價抗體及多價抗體。

圖 2-1 基因 SOEing 構(gòu)建 HBscFv 原理Fig. 2-1 Principle of construction of HBscFv by gene SOEin1 2 3Lane 1, PCR molecular markerLane 2, Negative controlLane 3, HBscFv PCR product (763bp)

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 王秀敏;煙草蝕紋病毒CP、HC-Pro基因克隆及與甘蔗花葉病毒之間交互保護(hù)作用的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2006年

2 張建新;西瓜花葉病毒基因組全序列分析及其蚜蟲體內(nèi)受體蛋白的分離與鑒定[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2007年

本文編號：2791711