【摘要】：第一部分：Kupffer細(xì)胞內(nèi)毒素耐受時(shí)TRAF3基因、蛋白表達(dá)及K-48泛素化水平變化 目的：觀察內(nèi)毒素耐受時(shí)，Kupffer細(xì)胞（KCs）內(nèi)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3(TRAF3)基因及蛋白表達(dá)變化，K-48泛素化水平以及下游細(xì)胞因子的分泌情況。方法：采用離體膠原酶消化、密度梯度離心聯(lián)合選擇性貼壁法分離KCs，F(xiàn)4/80免疫熒光染色鑒定KCs的純度，臺(tái)盼藍(lán)拒染及吞墨實(shí)驗(yàn)判斷KCs的活性及吞噬功能，光鏡下動(dòng)態(tài)觀察KCs隨時(shí)間的形態(tài)變化。將分離、培養(yǎng)的KCs以3-4×106密度接種于六孔板中，并隨機(jī)分為2組：①內(nèi)毒素耐受組（ETT Group）：給予10ng/mlLPS刺激24h后再給予300ng/ml LPS刺激；②內(nèi)毒素非耐受組(NETTGroup)：直接給予LPS刺激（300ng/ml）。兩組分別在處理后0，5，10，30，60min收獲細(xì)胞。熒光實(shí)時(shí)定量PCR（Q-PCR）檢測(cè)TRAF3mRNA表達(dá)變化，Western blotting及激光共聚焦檢測(cè)TRAF3蛋白變化及K48泛素化（K48-Ub）水平；ELISA法檢測(cè)KCs培養(yǎng)上清液中IL-1、IL-10，TNF-α的分泌情況。結(jié)果：（1）免疫熒光染色可見F4/80分子在細(xì)胞膜強(qiáng)表達(dá)，KCs純度大于92.0%，臺(tái)盼藍(lán)染色顯示細(xì)胞的活力均在98.5% 以上，吞墨試驗(yàn)見KCs吞噬大量碳素顆粒。（2）內(nèi)毒素耐受組與非耐受組TRAF3的mRNA表達(dá)量顯著在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)無顯著性差異（P0.05）；但耐受組TRAF3蛋白表達(dá)量在觀察時(shí)間段內(nèi)顯著高于非耐受組（P0.05）；耐受組與非耐受組相比，K-48泛素化水平明顯降低（P0.05）。（3）耐受組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1、TNF-α的量顯著低于非耐受組（P0.05）；耐受組IL-10分泌量顯著高于非耐受組（P0.05）。結(jié)論：內(nèi)毒素耐受時(shí)KCs細(xì)胞中TRAF3基因表達(dá)無明顯變化，TRAF3蛋白K-48泛素化降解受阻，導(dǎo)致TRAF3蛋白表達(dá)量相對(duì)增高。 第二部分：抑制TRAF3泛素化降解對(duì)MAPK及TRIF信號(hào)通路的影響 目的：細(xì)胞凋亡抑制蛋白2（cIAP2）是TRAF3的特異性泛素連接酶，本實(shí)驗(yàn)通過降低cIAP2的表達(dá)來抑制TRAF3的泛素化降解，探討TRAF3的降解被抑制后對(duì)KCs內(nèi)MAPK及TRIF信號(hào)通路的影響。方法：將分離純化的KCs以3-4106密度接種于六孔板中，隨機(jī)分為兩組：①轉(zhuǎn)染組：構(gòu)建載有cIAP2-shRNA的慢病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48h后給予LPS（300ng/ml）刺激。②對(duì)照組：轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒48h后給予LPS（300ng/ml）刺激。兩組分別于處理后0，5，10，30，60min收獲細(xì)胞，激光共聚焦檢測(cè)cIAP2、TRAF3及K-48Ub蛋白表達(dá)；Westernblotting檢測(cè)cIAP2、TRAF3、K-48Ub、JNK、p-JNK、p38、p-p38、TRIF及IRF3蛋白表達(dá)水平變化；ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1、TNF-α、IL-10的含量變化蛋白變化。結(jié)果：（1）轉(zhuǎn)染組cIAP2、K-48Ub蛋白表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)顯著低于對(duì)照組（P0.05）。（2）轉(zhuǎn)染組TRAF3、TRIF及IRF3蛋白表達(dá)量顯著性高于對(duì)照組（P0.05）。（3）兩組JNK、p38蛋白表達(dá)量無明顯變化；轉(zhuǎn)染組p-JNK和p-p38蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（P0.05）。（4）轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1、TNF-α的量顯著低于對(duì)照組（P0.05），IL-10的量顯著高于對(duì)照組。結(jié)論：抑制TRAF3的泛素化降解可以負(fù)性調(diào)控MAPK信號(hào)激活，正性調(diào)控TRIF信號(hào)活化，誘導(dǎo)KCs產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受。 第三部分：下調(diào)TRAF3的表達(dá)對(duì)Kupffer細(xì)胞內(nèi)毒素耐受的影響 目的：探討下調(diào)TRAF3的表達(dá)對(duì)KCs內(nèi)MAPK、TRIF信號(hào)通路活化以及內(nèi)毒素耐受的影響。方法：將分離純化的KCs以3-4106密度接種于六孔板中，隨機(jī)分為三組：①轉(zhuǎn)染組：構(gòu)建載有TRAF3-shRNA的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24h后給予小劑量LPS（10ng/ml）刺激，24h后再給予大劑量LPS（300ng/ml）刺激。②內(nèi)毒素耐受組：轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒24h后給予小劑量LPS（10ng/ml）刺激，等待24h后再給予大劑量LPS（300ng/ml）刺激。③內(nèi)毒素非耐受組：轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒24h后直接給予大劑量LPS（300ng/ml）刺激。三組分別于處理后0，30，60min收獲細(xì)胞，Western blotting檢測(cè)TRAF3、JNK、p-JNK、p38、p-p38、TRIF及IRF3蛋白表達(dá)水平變化；ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1、TNF-α、IL-10的含量變化蛋白變化。結(jié)果：（1）轉(zhuǎn)染組TRIF及IRF3蛋白表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)顯著低于內(nèi)毒素耐受組（P0.05），但高于內(nèi)毒素非耐受組（P0.05）。（2）三組JNK、p38蛋白表達(dá)量沒有明顯變化；轉(zhuǎn)染組p-JNK和p-p38蛋白表達(dá)量顯著高于內(nèi)毒素耐受組（P0.05），但低于內(nèi)毒素非耐受組（P0.05）。（3）轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1、TNF-α的量顯著高于內(nèi)毒素耐受組（P0.05），明顯低于內(nèi)毒素非耐受組（P0.05）。（4）轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-10的量顯著低于內(nèi)毒素耐受組（P0.05），但高于內(nèi)毒素非耐受組（P0.05）。結(jié)論：降低KCs內(nèi)TRAF3的蛋白表達(dá)損害內(nèi)毒素耐受的建立，但并不能完全消除內(nèi)毒素耐受效應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329.2

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2791465