發(fā)布時間：2020-08-13 03:38

【摘要】：第一部分：Kupffer細胞內(nèi)毒素耐受時TRAF3基因、蛋白表達及K-48泛素化水平變化 目的：觀察內(nèi)毒素耐受時，Kupffer細胞（KCs）內(nèi)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3(TRAF3)基因及蛋白表達變化，K-48泛素化水平以及下游細胞因子的分泌情況。方法：采用離體膠原酶消化、密度梯度離心聯(lián)合選擇性貼壁法分離KCs，F(xiàn)4/80免疫熒光染色鑒定KCs的純度，臺盼藍拒染及吞墨實驗判斷KCs的活性及吞噬功能，光鏡下動態(tài)觀察KCs隨時間的形態(tài)變化。將分離、培養(yǎng)的KCs以3-4×106密度接種于六孔板中，并隨機分為2組：①內(nèi)毒素耐受組（ETT Group）：給予10ng/mlLPS刺激24h后再給予300ng/ml LPS刺激；②內(nèi)毒素非耐受組(NETTGroup)：直接給予LPS刺激（300ng/ml）。兩組分別在處理后0，5，10，30，60min收獲細胞。熒光實時定量PCR（Q-PCR）檢測TRAF3mRNA表達變化，Western blotting及激光共聚焦檢測TRAF3蛋白變化及K48泛素化（K48-Ub）水平；ELISA法檢測KCs培養(yǎng)上清液中IL-1、IL-10，TNF-α的分泌情況。結(jié)果：（1）免疫熒光染色可見F4/80分子在細胞膜強表達，KCs純度大于92.0%，臺盼藍染色顯示細胞的活力均在98.5% 以上，吞墨試驗見KCs吞噬大量碳素顆粒。（2）內(nèi)毒素耐受組與非耐受組TRAF3的mRNA表達量顯著在各個時間點無顯著性差異（P0.05）；但耐受組TRAF3蛋白表達量在觀察時間段內(nèi)顯著高于非耐受組（P0.05）；耐受組與非耐受組相比，K-48泛素化水平明顯降低（P0.05）。（3）耐受組細胞培養(yǎng)上清液中IL-1、TNF-α的量顯著低于非耐受組（P0.05）；耐受組IL-10分泌量顯著高于非耐受組（P0.05）。結(jié)論：內(nèi)毒素耐受時KCs細胞中TRAF3基因表達無明顯變化，TRAF3蛋白K-48泛素化降解受阻，導(dǎo)致TRAF3蛋白表達量相對增高。 第二部分：抑制TRAF3泛素化降解對MAPK及TRIF信號通路的影響 目的：細胞凋亡抑制蛋白2（cIAP2）是TRAF3的特異性泛素連接酶，本實驗通過降低cIAP2的表達來抑制TRAF3的泛素化降解，探討TRAF3的降解被抑制后對KCs內(nèi)MAPK及TRIF信號通路的影響。方法：將分離純化的KCs以3-4106密度接種于六孔板中，隨機分為兩組：①轉(zhuǎn)染組：構(gòu)建載有cIAP2-shRNA的慢病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48h后給予LPS（300ng/ml）刺激。②對照組：轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒48h后給予LPS（300ng/ml）刺激。兩組分別于處理后0，5，10，30，60min收獲細胞，激光共聚焦檢測cIAP2、TRAF3及K-48Ub蛋白表達；Westernblotting檢測cIAP2、TRAF3、K-48Ub、JNK、p-JNK、p38、p-p38、TRIF及IRF3蛋白表達水平變化；ELISA檢測細胞上清液中IL-1、TNF-α、IL-10的含量變化蛋白變化。結(jié)果：（1）轉(zhuǎn)染組cIAP2、K-48Ub蛋白表達量在各時間點顯著低于對照組（P0.05）。（2）轉(zhuǎn)染組TRAF3、TRIF及IRF3蛋白表達量顯著性高于對照組（P0.05）。（3）兩組JNK、p38蛋白表達量無明顯變化；轉(zhuǎn)染組p-JNK和p-p38蛋白表達量顯著低于對照組（P0.05）。（4）轉(zhuǎn)染組細胞培養(yǎng)上清液中IL-1、TNF-α的量顯著低于對照組（P0.05），IL-10的量顯著高于對照組。結(jié)論：抑制TRAF3的泛素化降解可以負性調(diào)控MAPK信號激活，正性調(diào)控TRIF信號活化，誘導(dǎo)KCs產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受。 第三部分：下調(diào)TRAF3的表達對Kupffer細胞內(nèi)毒素耐受的影響 目的：探討下調(diào)TRAF3的表達對KCs內(nèi)MAPK、TRIF信號通路活化以及內(nèi)毒素耐受的影響。方法：將分離純化的KCs以3-4106密度接種于六孔板中，隨機分為三組：①轉(zhuǎn)染組：構(gòu)建載有TRAF3-shRNA的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24h后給予小劑量LPS（10ng/ml）刺激，24h后再給予大劑量LPS（300ng/ml）刺激。②內(nèi)毒素耐受組：轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒24h后給予小劑量LPS（10ng/ml）刺激，等待24h后再給予大劑量LPS（300ng/ml）刺激。③內(nèi)毒素非耐受組：轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒24h后直接給予大劑量LPS（300ng/ml）刺激。三組分別于處理后0，30，60min收獲細胞，Western blotting檢測TRAF3、JNK、p-JNK、p38、p-p38、TRIF及IRF3蛋白表達水平變化；ELISA檢測細胞上清液中IL-1、TNF-α、IL-10的含量變化蛋白變化。結(jié)果：（1）轉(zhuǎn)染組TRIF及IRF3蛋白表達量在各時間點顯著低于內(nèi)毒素耐受組（P0.05），但高于內(nèi)毒素非耐受組（P0.05）。（2）三組JNK、p38蛋白表達量沒有明顯變化；轉(zhuǎn)染組p-JNK和p-p38蛋白表達量顯著高于內(nèi)毒素耐受組（P0.05），但低于內(nèi)毒素非耐受組（P0.05）。（3）轉(zhuǎn)染組細胞培養(yǎng)上清液中IL-1、TNF-α的量顯著高于內(nèi)毒素耐受組（P0.05），明顯低于內(nèi)毒素非耐受組（P0.05）。（4）轉(zhuǎn)染組細胞培養(yǎng)上清液中IL-10的量顯著低于內(nèi)毒素耐受組（P0.05），但高于內(nèi)毒素非耐受組（P0.05）。結(jié)論：降低KCs內(nèi)TRAF3的蛋白表達損害內(nèi)毒素耐受的建立，但并不能完全消除內(nèi)毒素耐受效應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2

【共引文獻】

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本文編號：2791465