【摘要】： 骨骼肌占全身體重的40-45%，由肌細(xì)胞與神經(jīng)、血管組成，是機(jī)體重要的運動器官之一。各種創(chuàng)傷如車禍傷、槍彈傷、燒傷及部份內(nèi)科疾病如糖尿病、腫瘤和癱瘓所致的肢體壞疽都常伴肌組織損傷。正常肌肉再生主要由肌衛(wèi)星細(xì)胞（satellite cell，SC）完成，但SC數(shù)量少，且隨年齡增長而下降。對于嚴(yán)重或面積較大的肌損傷，SC不足以達(dá)到修復(fù)目的，創(chuàng)面最終被纖維結(jié)締組織替代而形成瘢痕，導(dǎo)致難愈性創(chuàng)傷，使機(jī)體運動失能并影響神經(jīng)、血管系統(tǒng)。利用組織工程技術(shù)，將適宜種子細(xì)胞附著在可選生物材料上植入肌損傷部位，促進(jìn)肌損傷早期修復(fù)是目前肌修復(fù)研究中的熱點課題。有學(xué)者將SC接種到聚羥基乙酸（polyglycolic acid，PGA）上植入動物腹腔大網(wǎng)膜中，發(fā)現(xiàn)30-40d后可形成含血管的功能性肌組織，但SC采集中的有創(chuàng)性、難獲得性及含量少的缺陷制約了其作為種子細(xì)胞的應(yīng)用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有向骨髓基質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞、成肌細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞分化的潛能，來源豐富，易于分離和培養(yǎng)，在體外可高度擴(kuò)增。1995年，Wakitani首先利用5-氮雜胞苷（5-azacytidine,5-Aza-CR）誘導(dǎo)MSCs分化為成肌細(xì)胞，為MSCs應(yīng)用于肌分化研究打下了基礎(chǔ)，但MSCs成肌分化的具體機(jī)制卻未見報道。 肌細(xì)胞的分化成熟受生肌調(diào)節(jié)因子（myogenic regulatory factors,MRFs）調(diào)控，這是一類稱為成肌堿性螺旋-環(huán)-螺旋的轉(zhuǎn)錄因子[myogenic basic helix-loop-helix(bHLH) transcription factors]，目前發(fā)現(xiàn)有Myf5、MyoD、myogenin和MRF4四種因子。MRFs家族基因在非肌細(xì)胞中異位表達(dá)時，可激活被表達(dá)細(xì)胞向成肌細(xì)胞分化，因此，推測5-Aza-CR誘導(dǎo)MSCs成肌分化時，MRFs相關(guān)基因的誘導(dǎo)表達(dá)可能是其分化的前提。 干細(xì)胞的分化過程是細(xì)胞感應(yīng)外源刺激信號，實現(xiàn)信號的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程。了解信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對于進(jìn)一步闡明基因調(diào)控機(jī)制，通過促進(jìn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來促進(jìn)干細(xì)胞定向分化有著重要意義。絲裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是信號從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)部的重要傳遞者，包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白(extracellular regulated protein kinase,ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、應(yīng)激 WP=10 活化蛋白激酶p38(stress-activaed protein kinase p38)及ERK5，該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)家族在細(xì)胞生長、應(yīng)激和細(xì)胞間功能同步等多方面具有重要作用。在SC成熟分化過程中，磷酯酰肌醇-3（羥基）激酶（phosphatidylinositol 3-OH kinase,PI3K）的激活可啟動其下游轉(zhuǎn)錄子Akt，促進(jìn)SC的成肌分化。胰島素樣生長因子-I（insulin-like growth factor,IGF-I）可以明顯增強(qiáng)SC成肌分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)肌分化，而在MSCs成肌分化中的作用尚無報道。若對比分析MSCs與SC成肌分化之間的調(diào)控差別，將從理論上深入闡明MSCs成肌分化的相關(guān)機(jī)理，在實踐上更好將MSCs應(yīng)用于肌損傷修復(fù)。 SC正常時處于靜止?fàn)顟B(tài)，在相關(guān)應(yīng)激如創(chuàng)傷情況下被激活，表達(dá)MRFs而定向成肌分化。當(dāng)SC受刺激后約3-12h，SC即開始表達(dá)MyoD/Myf5。但什么是誘導(dǎo)SC表達(dá)成肌分化調(diào)控因子的直接因素尚未可知。肌損傷傷口液中豐富的細(xì)胞因子和生長因子可能是潛在的誘導(dǎo)因子，但迄今尚不能肯定這些因子具有誘導(dǎo)SC成肌分化的作用，僅發(fā)現(xiàn)它們具有促進(jìn)或抑制SC增殖和分化的功能。有學(xué)者將單純的MSCs和經(jīng)5-Aza-CR誘導(dǎo)后的MSCs植入損傷后的心肌處，發(fā)現(xiàn)可明顯促進(jìn)心肌再生，增強(qiáng)心室心肌收縮能力，尤其經(jīng)5-Aza-CR誘導(dǎo)后的MSCs組效果顯著，但對創(chuàng)面中的局部因素對MSCs成肌分化的影響卻未見分析。 本研究以MSCs成肌分化的基因調(diào)控及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等分子機(jī)制為出發(fā)點，通過與SC成肌分化的過程比較，證實MSCs定向肌分化的相關(guān)機(jī)理；同時通過不同類型MSCs的移植，觀察其在肌損傷部位的分化情況，探討MSCs用于肌損傷修復(fù)的有效途徑。主要實驗方法及結(jié)果如下： 一、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成肌誘導(dǎo)分化策略的研究： 1、濃度的選定：分別選用0、1、3、5、10、20（μmol/L）濃度的5-Aza-CR作用于MSCs，以MTT法分析不同濃度5-Aza-CR作用后，Balb/C小鼠MSCs的增殖情況，發(fā)現(xiàn)以5μmol/L、10μmol/L濃度為刺激MSCs增殖分化的最佳濃度。 2、成肌相關(guān)基因表達(dá)的檢測：以5、10μmol/L兩組濃度5-Aza-CR作用于MSCs，RT-PCR檢測誘導(dǎo)后生肌因子5（myogenic factor 5，Myf5）及成肌素（myogenin）的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10μmol/L組誘導(dǎo)6h，MSCs開始表達(dá)Myf5，9h達(dá)最高；5μmol/L組誘導(dǎo)9h，MSCs開始表達(dá)Myf5，12h達(dá)高峰。10μmol/L組誘導(dǎo)24h，MSCs開始表達(dá)myogenin，48h達(dá)最高；5μmol/L組誘導(dǎo)6d，MSCs開始表達(dá)myogenin，且為高峰。 3、成肌相關(guān)蛋白的檢測：以5、10μmol/L兩組濃度5-Aza-CR作用于MSCs，免疫組織化學(xué)染色法檢測誘導(dǎo)后肌分化下游蛋白結(jié)蛋白（desmin）、α-橫紋肌肌動蛋白（α-sarcomeric）及肌球蛋白（myosin）的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10μmol/L 5-Aza-CR誘導(dǎo)7d，部份MSCs表達(dá)desmin陽性，至14d表達(dá)程度明顯增強(qiáng)；5μmol/L 5-Aza-CR WP=11 誘導(dǎo)10d，MSCs表達(dá)desmin陽性。10μmol/L 5-Aza-CR誘導(dǎo)10d，部份MSCs表達(dá)α-sarcomeric陽性，
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 楊明升,劉紅林,陳杰;印記基因的印記機(jī)制及其表達(dá)調(diào)控[J];生命的化學(xué);2002年01期

本文編號：2785596