【摘要】： 研究背景和目的： 骨關(guān)節(jié)炎是最常見的關(guān)節(jié)炎,隨著世界人口的老齡化,骨關(guān)節(jié)炎患者在逐年增加。骨關(guān)節(jié)炎是關(guān)節(jié)的主要致殘的原因,大多數(shù)藥物只是控制疼痛,而不能逆轉(zhuǎn)關(guān)節(jié)損害。外科手術(shù)可以改善關(guān)節(jié)功能,如關(guān)節(jié)鏡、截骨、關(guān)節(jié)置換等,但外科手術(shù)一般效果不滿意。因此,需要更有效的改善功能的治療方法。 近年來,通過天然或生物工程方法修復(fù)受損組織的再生醫(yī)學(xué)成為熱點,這些方法包括骨軟骨移植、自體軟骨細胞移植等。自體軟骨細胞移植已經(jīng)開展十余年,臨床中也采用一些改良的自體軟骨細胞移植術(shù)。但是仍有一些缺陷,如缺少細胞來源、損害正常組織、不能形成原有軟骨結(jié)構(gòu)、與周圍組織不完全結(jié)合等。 近年來間充質(zhì)干細胞的研究為軟骨移植提供了新的方法。在胚胎發(fā)展過程中,軟骨是有間充質(zhì)干細胞聚集后分化而成的。目前,間充質(zhì)干細胞已從骨髓、骨膜、脂肪、滑膜、肌肉等多個組織中分離獲得,并證實具有向不同結(jié)締組織分化的能力,如骨、軟骨、脂肪、椎間盤、韌帶和肌肉。目前,新的研究方向主要是加強和延長體外軟骨細胞的分化潛能。 MicroRNAs是19-23個核苷酸的單鏈RNA,存在于廣泛的生物體中。在研究干細胞功能的分子Loquacious和DGCR8時,研究者發(fā)現(xiàn)microRNA在干細胞功能和分化過程中起重要作用。產(chǎn)生microRNA的關(guān)鍵酶Dicer敲除后,間充質(zhì)干細胞分化為軟骨的功能受損。以上均證明microRNA是干細胞分化機制中的重要分子。 我們的課題基于文獻的復(fù)習(xí)和前期的骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)的實驗基礎(chǔ),研究microRNA在骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)分化為軟骨細胞的過程中的調(diào)節(jié)作用,探索誘導(dǎo)分化的機制,優(yōu)化骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化的條件,誘導(dǎo)出軟骨細胞,為軟骨移植提供細胞來源,最終解決骨關(guān)節(jié)炎的治療問題。 實驗方法： 1、提取大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,體外經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)其向軟骨細胞分化。通過相差顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察,免疫熒光法、免疫組化法檢測軟骨細胞特異性標(biāo)志Ⅱ型膠原,阿辛蘭染色檢測氨基葡聚糖的方法證實大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)過體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后是否具有成熟軟骨細胞的標(biāo)志。 2、從大鼠骨髓中分離間充質(zhì)干細胞,體外經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)分化為軟骨細胞。分別于TGF-β1誘導(dǎo)前(d0)、誘導(dǎo)培養(yǎng)7天(d7-induced)和無TGF-β1誘導(dǎo)培養(yǎng)7天(d7-non-induced)三個時間點,應(yīng)用實時定量逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(real time RT-PCR)方法檢測三個時間點細胞的microRNA130a的表達水平。 3、Hulth法建立兔關(guān)節(jié)炎模型。剪斷兔膝關(guān)節(jié)前后交叉韌帶及內(nèi)側(cè)半月板以改變膝關(guān)節(jié)的生物力學(xué)狀態(tài)。手術(shù)后12周進行Maknin評分。 研究結(jié)果： 1、大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后細胞具有成熟軟骨細胞的形態(tài)。應(yīng)用Ⅱ型膠原特異性抗體進行的免疫熒光染色顯示骨髓基質(zhì)干細胞在分化第14天、21天,細胞質(zhì)中充滿了大量綠色特異性染色,而在未誘導(dǎo)培養(yǎng)的細胞中,未發(fā)現(xiàn)特異性熒光染色。應(yīng)用Ⅱ型膠原特異性抗體進行的組織化學(xué)染色顯示骨髓基質(zhì)干細胞在分化2天、7天、14天、21天后,細胞質(zhì)中充滿了大量棕色特異性染色,而在無誘導(dǎo)培養(yǎng)的細胞中,未發(fā)現(xiàn)特異性染色。經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的細胞于第2、7、14、21天在細胞內(nèi)均可呈現(xiàn)阿辛蘭染色陽性物質(zhì),含有軟骨細胞分泌的特異的蛋白聚糖。而未誘導(dǎo)培養(yǎng)組細胞無陽性染色物質(zhì)。 2、軟骨細胞分化過程中均表達microRNA130a。骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)7天后,誘導(dǎo)分化組和未誘導(dǎo)分化組細胞都有不同程度的表達水平下調(diào)。經(jīng)7天培養(yǎng),TGF-β1誘導(dǎo)分化組細胞表達microRNA130a水平顯著低于誘導(dǎo)培養(yǎng)前(P＜0.05)。經(jīng)7天培養(yǎng)后,誘導(dǎo)分化組細胞表達microRNA130a水平顯著低于未誘導(dǎo)分化組(P＜0.1)。 3、Hulth法可建立兔關(guān)節(jié)炎的模型。12周Maknin評分9-10分。 研究結(jié)論： 1、大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞在生長因子TGF-β的誘導(dǎo)培養(yǎng)下可以分化為具有成熟軟骨細胞形態(tài)和特異標(biāo)志的軟骨細胞樣細胞。 2、骨髓間充質(zhì)干細胞在向軟骨細胞分化的早期,從第1天到第7天,microRNA130a表達水平顯著下調(diào),microRNA130a參與了軟骨形成的過程。推測microRNA130a可能通過Runx3調(diào)控軟骨細胞分化。 3、Hulth法可建立骨關(guān)節(jié)炎模型。
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R329
【圖文】：

呈散在圓形。經(jīng)篩選培養(yǎng)7天后，部分細胞開始貼壁，并伸出偽足;經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)7d后，貼壁細胞開始增殖，細胞數(shù)量增多，貼壁細胞伸展，細胞扁平，呈多腳形態(tài)，覆蓋培養(yǎng)瓶底面積的50%以上(圖1一A);經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)14天后，貼壁細胞明顯增殖細胞數(shù)量明顯增多，且貼壁細胞胞漿豐富，細胞呈多角形逐漸向四周鋪展，初步具有軟骨細胞形態(tài)(圖1一C);至誘導(dǎo)分化培養(yǎng)21天時，細胞已全部密集覆蓋于培養(yǎng)瓶底。未誘導(dǎo)培養(yǎng)組細胞培養(yǎng)7天后(圖1一B)，細胞多為長梭形且方向一致密集排列;與之形成鮮明對比，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)7天的骨髓間充質(zhì)干細胞，細胞多為多邊形，細胞間連接緊密，表現(xiàn)為軟骨細胞形態(tài)(圖1一A)。

型膠原特異性抗體進行的免疫熒光染色顯示骨髓基質(zhì)干細胞在分化第14天、21天，細胞質(zhì)中充滿了大量綠色特異性染色，而在未誘導(dǎo)培養(yǎng)的細胞中，未發(fā)現(xiàn)特異性熒光染色(圖2)。A:誘導(dǎo)培養(yǎng)第14天B:誘導(dǎo)培養(yǎng)第21天C:未誘導(dǎo)培養(yǎng)第21天圖2人鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化過程中，H型膠原的免疫熒光染色。A:大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞誘導(dǎo)分化14天H型膠原特異性免疫熒光染色(綠色熒光，xZoo);

G:誘導(dǎo)培養(yǎng)第21天H:未誘導(dǎo)培養(yǎng)第21天圖3大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化過程中，H型膠原的免疫組化染色大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞誘導(dǎo)分化2天H型膠原特異性免疫組化染色間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞誘導(dǎo)分化7天H型膠原特異性免疫組化染色;E:大鼠細胞向軟骨細胞誘導(dǎo)分化14天H型膠原特異性免疫組化染色;G:大鼠骨髓間軟骨細胞誘導(dǎo)分化21天H型膠原特異性免疫組化染色;B、D、F、H:未誘導(dǎo)培2天、7天、14天、21天無明顯H型膠原特異性免疫組化染色。三、體外誘導(dǎo)分化的軟骨細胞細胞外氨基葡聚糖的表達經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的細胞于第2、7、14、21天在細胞內(nèi)均可呈現(xiàn)阿辛蘭質(zhì)，含有軟骨細胞分泌的特異的蛋白聚糖。而未誘導(dǎo)培養(yǎng)組細胞無陽

【參考文獻】

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1 白希壯，任繼堯;選擇性臀肌切斷誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎實驗?zāi)Ｐ蚚J];中華骨科雜志;1994年02期

本文編號：2782556