【摘要】：端粒是位于真核生物染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，在維持基因組的穩(wěn)定性和完整性中發(fā)揮著重要的作用。端粒損傷與衰老和癌癥的發(fā)生存在密切地聯(lián)系。在哺乳動物細胞中，越來越多的研究結(jié)果揭示了端粒核心相關(guān)蛋白在端粒處的組裝過程以及端粒蛋白復合體如何招募端粒酶和其它蛋白因子來維持和保護端粒。然而，關(guān)于細胞生長信號通路變化對端粒以及端粒結(jié)合蛋白影響的研究卻不是很清楚。作為研究的最為廣泛和經(jīng)典的細胞生長信號途徑，磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信號通路在調(diào)控細胞增殖、存活、代謝以及DNA修復等細胞功能中發(fā)揮著重要作用。磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信號通路出現(xiàn)紊亂與衰老、癌癥和糖尿病等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。 在我們的研究中，我們提供了充分的證據(jù)，證明了Akt信號通路在端粒保護中起著重要的作用。利用Akt信號通路的化學抑制劑或者小分子干擾RNA抑制Akt活性，均會引發(fā)端粒損傷。另外，我們還發(fā)現(xiàn)端粒蛋白TPP1可以通過其折疊結(jié)構(gòu)域（OB）形成同源寡聚體，并且這個過程受Akt活性的調(diào)控。抑制Akt活性會破壞TPP1寡聚化并誘發(fā)端粒損傷，伴隨著端粒蛋白TPP1和POT1在端粒處招募量的下降�？傊�，我們的研究結(jié)果建立了Akt信號通路和端粒保護之間新的聯(lián)系。 主要研究結(jié)果如下： （1）Akt活性在端粒末端保護中起著重要作用。HTC75細胞利用血清饑餓處理過夜，細胞除了表現(xiàn)出細胞增殖受到抑制之外，還發(fā)現(xiàn)端粒處會有DNA修復指示蛋白53BP1的聚集，暗示了細胞端粒對營養(yǎng)條件的變化比較敏感，細胞生長信號通路可能在端粒維持和保護中起到正調(diào)控的作用。利用Akt活性特異抑制劑Triciribine處理細胞，端粒會出現(xiàn)明顯的損傷信號，而細胞去除Trciribine之后端�；謴驼�，證明了Akt活性在端粒保護中發(fā)揮重要的作用。 （2）Akt活性對端粒蛋白TPP1和POT1在端粒處的招募起著非常重要的作用。利用Akt活性特異抑制劑Triciribine處理細胞，不會影響其端粒核心蛋白的表達水平，然而通過染色質(zhì)免疫沉淀實驗（ChIP）分析，試驗結(jié)果表明了Triciribine處理后會降低端粒蛋白TPP1和POT1在端粒上的結(jié)合量。 （3）Akt1在端粒保護中起著最主要的作用。通過小分子RNA干擾實驗證明了Akt1而不是Akt2或Akt3在端粒保護中發(fā)揮著最主要作用。另外，實驗結(jié)果也證明了RNAi耐受的野生型Akt1而不是激酶失活型Akt1K179M能恢復（rescue）由于Akt1沉默誘發(fā)的端粒損傷。總之，Akt1的激酶活性在端粒保護中發(fā)揮著主要的作用。 （4）TPP1能夠通過OB折疊結(jié)構(gòu)域介導寡聚化。通過雙分子熒光互補（BiFC）和免疫共沉淀（Co-IP）實驗，表明了TPP1可以在體內(nèi)形成寡聚體。采用原核表達和體外純化TPP1的OB折疊結(jié)構(gòu)域，通過體外GST下拉實驗發(fā)現(xiàn)TPP1通過OB折疊結(jié)構(gòu)域介導寡聚化。野生型TPP1而不是OB折疊結(jié)構(gòu)域缺失的TPP1能恢復（rescue）由于Akt1沉默誘發(fā)的端粒損傷，證明了TPP1寡聚化在端粒保護中發(fā)揮重要作用。 （5）TPP1寡聚化的形成受Akt1活性的影響。利用Akt活性特異抑制劑Triciribine處理或者小分子RNA干擾細胞，均會破壞TPP1寡聚化。在細胞中過量表達Akt1，能夠加強TPP1寡聚化的形成；RNAi耐受的野生型Akt1而不是激酶失活型Akt1K179M能恢復（rescue）由于Akt1減少造成的TPP1寡聚化破壞。總之，Akt1的活性在TPP1寡聚化形成過程中起著關(guān)鍵作用。
【學位授予單位】：中山大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R3416
【圖文】：

端的 T 環(huán)（T-loop）結(jié)構(gòu)（圖 1-1）。由于富含 G，它可形成一種由富含鳥嘌呤的核酸序列所構(gòu)成的四股型態(tài)，稱為端粒 G-四鏈體[18]。端粒的每四個TTAGGG 重復序列可形成一個端粒 G 四鏈體。在人類和老鼠細胞中通過電子顯微鏡觀察交聯(lián)之后去除蛋白的端粒 DNA，首次發(fā)現(xiàn)了端粒 T 環(huán)結(jié)構(gòu)[19]，之后在雞和老鼠中通過無交聯(lián)非變性端粒染色體的分離同樣也發(fā)現(xiàn)了 T 環(huán)結(jié)構(gòu)的存在[20]。A

TRF2 的缺失會誘發(fā)小鼠以及人的染色體末端 ATM 激活[34, 83]。端粒傷反應(yīng)可以引起 DNA 損傷反應(yīng)因子γ-H2AX 和 53BP1 在端粒的聚集粒損傷誘導 foci（TIF, telomere dysfunction-induced foci）[84]會接著激活 p53 依賴的細胞周期阻滯和細胞凋亡[85, 86]。與 TRF2 不夠抑制端粒發(fā)生 ATR 信號激活（圖 1-3）[34]。在老鼠里面缺失兩個因能引起端粒損傷反應(yīng)，在這個過程中只有 ATR 的激活而不是 ATM，TRF2 和 POT1 相對獨立的抑制端粒處可能會發(fā)生的兩個主要的 D通路，防止端粒被誤識別成 DNA 雙鏈斷裂而造成不必要的 DNA 修復端粒以及協(xié)調(diào)細胞周期的進行。

圖 1-4 端粒調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（引自 Huawei Xin, Dan Liu and Zhou Songyang.2008.Genome BFigure 1-4 The telomere interactome圖中顯示了大多數(shù)已報道的以端粒蛋白為核心的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。通蛋白相互作用，來實現(xiàn)對端粒保護和維持等功能的調(diào)控。DNA 損傷和修復信號通路相關(guān)蛋白在端粒功能調(diào)控中發(fā)揮用。TRF1 和 TRF2 與 DNA 損傷反應(yīng)信號通路有著非常緊密的聯(lián)TRF2 結(jié)合在端粒上，能夠防止端粒被誤識別成 DNA 斷裂。TRF1作用，在體內(nèi)和體外實驗中 TRF1 都能被 ATM 磷酸化，磷酸化后粒 DNA 結(jié)合能力下降[94]。另外，ATM 介導的 TRF1 的磷酸化需 M參與[94]， MRN 復合體同樣也對 TRF1 的活性起著調(diào)控作用。過

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉春榮;中國城市社區(qū)選舉的想象:從功能闡釋到過程分析[J];社會;2005年01期

本文編號：2780361