【摘要】：肝臟作為免疫器官，承擔著耐受和免疫的雙重功能。兩者間的精妙平衡依賴于肝內(nèi)定居的各種免疫細胞和外周白細胞之間的復雜相互作用網(wǎng)絡。長期以來，盡管肝臟免疫耐受（肝移植）和免疫低反應性（病毒慢性感染）早已被公認，但具體的機制還很不清楚。該屬性使得肝臟成為病原體的靶器官，一些病原體如HBV則逃脫免疫控制而在肝細胞長期存在。 HBV是嗜肝性DNA病毒。HBV感染導致慢性肝炎，肝硬化和肝細胞癌，是威脅到人類健康的世界性衛(wèi)生問題。就病毒本身而言，對肝細胞并無直接的病變作用。其對肝臟的巨大損傷來之病毒慢性感染誘導的免疫反應，由早期的應答不充分到中期的衰竭及后期的免疫紊亂。因此，機體針對病毒的免疫反應被認為是引起肝臟疾病的重要原因。而同時機體針對病毒的免疫反應也完全介導了病毒的清除。免疫反應的雙刃劍角色，讓我們干預處理慢性感染時，尋找合適的平衡點，就顯得尤為重要。 HBV感染后，積極有效的清除病毒，依賴于天然免疫和繼發(fā)免疫的共同調(diào)節(jié)作用。在CD4+T細胞的輔助下，CD8+T細胞通過細胞毒和非細胞毒機制，清除感染的靶細胞。因此，CD8+T細胞的功能和狀態(tài)在決定病毒感染的進程上起著決定性的作用。很遺憾的是，慢性感染時，CD8+T細胞常常處于衰竭狀態(tài)。當前的研究發(fā)現(xiàn)了多種與之相關免疫信號轉(zhuǎn)導通路。包括細胞膜表面高表達以PD-1為代表的多種抑制性受體，這些負調(diào)控分子限制了T細胞抗病毒效應；其次，在微環(huán)境下，其它細胞分泌的調(diào)節(jié)性因子，如IL-10，TGF-β調(diào)節(jié)和抑制抗病毒免疫反應；第三，調(diào)節(jié)性細胞，如FoxP3+的天然和誘導的調(diào)節(jié)性細胞（Tregs）、調(diào)節(jié)性CD8+T細胞和髓來源抑制細胞，以cell-to-cell的接觸方式，抑制APC的成熟、分泌調(diào)節(jié)性細胞因子和直接減弱T細胞的功能；最后，職業(yè)和非職業(yè)抗原遞呈細胞的改變給予T細胞的不適當刺激信號。由細胞和分子構成的綜合體系，編織了一套復雜的抑制性網(wǎng)絡，抑制CD8+T細胞的抗病毒功能，從而促進病毒的持續(xù)性感染。 當前，治療乙肝，日益被國際認可的趨勢是：雙管齊下，聯(lián)合治療。既要抗病毒，又要調(diào)免疫。僅抑制病毒復制無法恢復受損的免疫系統(tǒng)。降低病毒載量，提升免疫能力，打破免疫耐受，以恢復患者的抗病毒免疫應答，最終達到持久清除病毒、恢復機體保護性免疫。目前免疫調(diào)節(jié)藥物有DC疫苗療法，CIK細胞療法和免疫負調(diào)節(jié)分子（PD-1,IL-10, LAG-3, TIM-3等）阻斷法。HBV特異性T細胞功能受損是機體無法清除病原體的關鍵原因之一，而免疫負調(diào)節(jié)分子又是促使T細胞功能衰竭的關鍵因素，因此以T細胞免疫負調(diào)節(jié)分子為靶標，封閉其抑制功能從而恢復T細胞的免疫反應，尤其是起關鍵效應功能的CD8+T細胞，重獲抗病毒能力。 LSECtin是Ⅱ型跨膜糖蛋白，位于人類染色體19p13.3，是C型凝集素家族的新成員，該家族成員包括CD23、DC-SIGN、DC-SIGNR。LSECtin結合Ebola病毒，SARS冠狀病毒，纖絲病毒，Lassa病毒，促進細胞對日本腦炎病毒的易感性。我們實驗室的前期研究結果表明LSECtin以Ca2+依賴的方式，結合活化的T細胞表面的N-鏈接的糖蛋白，抑制T細胞的增殖，降低T細胞分泌IFN-γ，IL-2的水平，從而負調(diào)節(jié)T細胞的免疫應答。這促使我們想知道LSECtin在HBV感染時的免疫調(diào)節(jié)功能。 我們計劃構建HBV急性感染，慢性感染小鼠模型。在模型小鼠里，我們通過過表達LSECtin蛋白和敲除LSECtin，以及封閉LSECtin等手段，多層次多角度探索LSECtin在HBV感染時的免疫功能。 由于HBV感染宿主的偏嗜性：人和猩猩，以及HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的天生中樞耐受，長期以來限制了在小動物模型上研究HBV導致的免疫反應。直到近年來， Francis V.Chisari團隊和臺灣陳培哲團隊分別首次建立了HBV急性感染和慢性感染小鼠模型。為研究HBV提供了強有力的工具。我們嘗試建立該模型，通過劑量優(yōu)化，檢測體系和評價體系摸索，我們成功的建立了HBV急性感染的小鼠模型，可持續(xù)2周左右；同時，我們還建立抗原持續(xù)時間更長一些的急性感染模型，抗原的持續(xù)時間可達1個月。最后，我們建立了慢性感染模型，滿一年后，仍有1/3的小鼠，表面抗原為陽性。 首先，我們在Balb/c背景的LSECtin敲除小鼠里建立兩種急性模型，缺失LSECtin后，血清中表面抗原和E抗原的水平更低，肝細胞中核心抗原下降，表面抗原的陽性率更低。反之，我們利用質(zhì)粒在小鼠體內(nèi)過表達LSECtin，則延緩病毒抗原清除。在C57BL/6背景的慢性模型中，敲除LSECtin，加速抗原的清除，小鼠有更低的表面抗原陽性率，這和急性模型的表型一致�？傊琇SECtin可以延緩病毒抗原的清除，動物表型提示LSECtin可能是病毒持續(xù)感染的“幫兇”。 LSECtin是通過什么機制延緩病毒抗原清除的呢？LSECtin作為繼發(fā)免疫的負調(diào)控分子，減弱繼發(fā)免疫反應，結合活化的T細胞，抑制T細胞的增殖，降低T細胞分泌IFN-γ和IL-2的水平。而CD8+T細胞在決定病毒感染的發(fā)生發(fā)展有至關重要的作用。于是，我們探討LSECtin是否抑制了CD8+T細胞的抗病毒功能。建模后，比較WT和KO小鼠肝臟淋巴細胞中CD8+T細胞的表型，我們發(fā)現(xiàn)，缺失LSECtin后，CD8+T細胞呈現(xiàn)CD25highCD62LlowCD127low的表型，而這群細胞正是發(fā)揮抗病毒效應的細胞。提示LSECtin可能抑制CD8+T細胞的活化及效應。進一步的ELISpot實驗，也提示LSECtin抑制病毒特異性T細胞分泌IFN-γ的能力，肝臟混合淋巴細胞中CD8+T細胞是分泌抗病毒關鍵因子IFN-γ的主要來源�？傊w內(nèi)外實驗，提示LSECtin可能通過降低表型為CD25highCD62LlowCD127low的CD8+T細胞群比例，抑制肝臟內(nèi)淋巴細胞分泌效應因子IFN-γ的能力，從而導致延緩病毒抗原清除。 在表型確鑿和機制上有初步探討后，我們想在應用有所嘗試。小分子化合物GlcNAcβ1-2Man是LSECtin的高親和力配基。Ki值為3.5+0.4μM。近期研究發(fā)現(xiàn)，GlcNAcβ1-2Man可阻斷LSECtin與Ebola病毒，Lassa病毒等病毒的相互結合，此外，該化合物還可封閉LSECtin對日本腦炎病毒的識別，降低細胞的易感性。但是，GlcNAcβ1-2Man在體內(nèi)是否有封閉功能，國際上未有報道。我們建立HBV慢性感染小鼠模型，腹腔注射13μM的GlcNAcβ1-2Man，持續(xù)六周，令人吃驚的是，糖注射組比PBS組有更低的表面抗原和E抗原水平，表面抗原陽性率更低，暗示GlcNAcβ1-2Man可作為LSECtin的功能性阻斷劑。 綜上所述，LSECtin作為免疫負調(diào)控分子，抑制CD8+T細胞的抗病毒的功能，可能是病毒持續(xù)感染的“幫兇”。小鼠體內(nèi)實驗提示LSECtin的高親和力配基GlcNAcβ1-2Man可封閉其抑制T細胞反應的功能，從而加速病毒抗原清除。綜合提示LSECtin可能被作為潛在的靶分子，用來干預或治療HBV。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R512.62;R-332
【圖文】：

圖 2 質(zhì)粒 pAAV/HBV1.2 注射 Balb/c 小鼠后，成功建立 HBV 急性感染小鼠模注射后，按圖示時間點收集樣品。20 倍稀釋血清，ELISA 檢測表面抗原（A）（B）。免疫組化染色檢測肝細胞內(nèi)的核心抗原（C）。4.3 用 pAAV/HBV1.2 質(zhì)粒建立 HBV 慢性感染小鼠模型為了建立慢性感染模型，質(zhì)粒的劑量不能太高，也不能太低。為獲得合適量，我們選擇了三種劑量 3μg，5 μg 和 10 μg 。用生理鹽水調(diào)整質(zhì)粒 pAAV/H濃度，然后經(jīng)尾靜脈 5sec 內(nèi)注射 C57BL/6 小鼠。從注射開始計時，第 10 周時釋血清，表面抗原的水平見圖 3A。從注射開始計時，分別于實驗第 4 周、第 7 周、第 9 周、第 13 周、第 16 周、第 24 周、第 28 周、第 32 周、第 36 周、第 40 周、第 44 周、第 52 周和第集血清，用 PBS 緩沖液稀釋至 20 倍體積后送至解放軍 307 醫(yī)院檢測 HBsAg 的果小鼠血清 20 倍稀后 COI 數(shù)值大于 1，檢測結果判定為陽性。持續(xù)監(jiān)測到第陽性率見圖 3 B，仍然高達 30%以上。HBV-DNA 的檢測數(shù)據(jù)見圖 3 C。

BD圖4. 敲除LSECtin后，急性感染小鼠體內(nèi)抗原清除速率加快。Balb/c 背景WT和LSECtinKO 小鼠，用 pBS-HBV1.3 建模，按時間點收集血清。20 倍稀釋，ELISA 檢測血清中的HBsAg（A）和 HBeAg（B）的水平。4.2 質(zhì)粒 pBS-HBV1.3 急性 HBV 感染小鼠模型中，過表達 LSECtin 抑制抗原清除小鼠體內(nèi)缺少 LSECtin 后，病毒抗原清除加快。反之，過表達 LSECtin，可以抑制抗原清除嗎？于是

. 敲除 LSECtin 后，慢性感染小鼠體內(nèi)抗原清除速率加快；表面抗BL/6 背景 WT 和 LSECtin KO 小鼠，用 pAAV-HBV1.2 建模，ELAg（A）；表面抗原的數(shù)值，COI>1 判斷為陽性，WT 和 KO 小鼠的結本章里，在我們成功構建 HBV 急性感染和慢性感染疾病模型Ctin 敲除小鼠來探索其功能。在 Balb/c 背景小鼠敲除 LSECtin，無論 pAAV/HBV1.2 質(zhì)粒建模，均呈現(xiàn)一致的表型：缺失 LSECtin 后 E 抗原清除加快；肝細胞中核心抗原的含量更低。反過來，在野用 pBS-HBV1.3 建模，同時過表達 LSECtin，與對照組相比，過抗原和 E 抗原的清除。一反一正，兩個方面證明了 LSECtin 延緩同時，在令人更為關心的慢性模型里。用 pAAV/HBV1.2 質(zhì)粒在，敲除 LSECtin 后，小鼠體內(nèi)的表面抗原水平更低，到第 12 周而 WT 小鼠還高達 50%左右。

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本文編號：2780293