【摘要】： 前言 艾滋病，即獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)引起的一種免疫缺陷性疾病。人體感染HIV后，致使機(jī)體免疫功能逐漸降低，最后因各種機(jī)會性感染而死亡。HIV感染流行難以控制的主要原因是其基因具有高度變異性，目前HIV感染／AIDS尚無法治愈，也無有效的疫苗預(yù)防。截止到2002年底全世界HIV感染人數(shù)已達(dá)6000萬，已有2400萬人死于艾滋病。到2002年12月我國HIV感染人數(shù)已超過100萬，正處于艾滋病快速增長期。因此，有效地預(yù)防和治療艾滋病已成為當(dāng)務(wù)之急。 人體感染了HIV以后數(shù)年至數(shù)十年內(nèi)可出現(xiàn)持續(xù)性CD4細(xì)胞數(shù)下降，最終導(dǎo)致免疫缺陷，出現(xiàn)艾滋病的各種臨床癥狀。在疾病進(jìn)展過程中，不同個體CD4細(xì)胞數(shù)的下降速率相差很大。研究表明，在發(fā)病和病情變化的過程中，病毒的變異和宿主因素是決定病程進(jìn)展的關(guān)鍵因素。目前在研究AIDS疾病進(jìn)展時，只選擇CD4+細(xì)胞計數(shù)及病毒載量這兩個評價指標(biāo)，但由于HIV-1具有高度的變異性，在全球不同地區(qū)流行株的分離及其生物學(xué)特性的研究都具有十分重要的意義。國外許多研究表明HIV-1生物學(xué)特性是決定病程進(jìn)展的關(guān)鍵因素，其中HIV-1細(xì)胞嗜性及準(zhǔn)種的變化直接反映病毒的細(xì)胞趨向性、變異頻率以及復(fù)制能力，清楚地顯示了在體內(nèi)的HIV-1對疾病進(jìn)展的影響，故目前有關(guān)HIV-1感染人體后疾病進(jìn)程中細(xì)胞嗜性、準(zhǔn)種的變化受到人們越來越多的關(guān)注。 大量數(shù)據(jù)表明，對于HIV感染的敏感性及在進(jìn)展到AIDS的過程中宿主的遺傳背景是一個重要的決定因素。人類白細(xì)胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)是人類主要的遺傳標(biāo)志，具有高度多態(tài)性，其多態(tài)性的差異決定個體免疫應(yīng)答的不同。艾滋病經(jīng)性接觸和血液等途徑傳播，但并不是所 有暴露于HIV的人都被HIV感染，感染者的疾病進(jìn)程也有著明顯的個體差 異。國外研究表明，對于 HIV易感性及 AIDS的疾病進(jìn)展情況，宿主的 HLA 特性是一個重要因素，在抗HIV感染中發(fā)揮重要作用。具有細(xì)胞毒性T淋 巴細(xì)胞＊ T lymPhocyte，CTL）活性的 CDS＋T淋巴細(xì)胞通常與 HLA I類分子抗原決定簇反應(yīng)后發(fā)揮作用，在HIV感染中CTL功能是免疫重建 的重要指標(biāo)。 本文通過微量全血分離法分離17株HIV一病毒并研究其生物學(xué)嗜 性、復(fù)制動力隨疾病進(jìn)展的變化，應(yīng)用異源雙鏈泳動分析（Heteroduplex mobility assay，HMA）的方法研究48例 HIV－l準(zhǔn)種的變化與疾病進(jìn)展的 相關(guān)性，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一序列特異性引物技術(shù)kolymerase chain re－ “”t’“”－SPednc sequence Primers，PCR一SSP）檢測46例中國 HIV感染者及 AIDS患者HLA－A在八位點等位基因特異性，探討HIV感染與HLA的相 關(guān)性。 材料與方法 二．研究對象 HIV／AIDS病例全部由中國醫(yī)科大學(xué)附屬一院艾滋病確認(rèn)實驗室經(jīng) WB試驗確認(rèn)為HIV感染陽性。傳播途徑包括靜脈吸毒、性傳播及輸血等 方式。所有標(biāo)本均在未接受抗病毒治療以前采集。根據(jù)《中華人民共和國 HIV／AIDS診斷標(biāo)準(zhǔn)補(bǔ)CD4＋T細(xì)胞數(shù)3200個／ul判斷為無癥狀HIV感染 期；CD4＋T細(xì)胞數(shù)＜200什ul判斷為 AIDS期。 2．26例HIV／AIDS病毒分離 應(yīng)用微量全血分離法從26例HIV／AIDS病例中分離得到17株HIV一二 病毒，并將分離得到的病毒株增殖，測定其半數(shù)組織細(xì)胞感染量（Tissue cell InfeCtioll dose 50助，TCID50）。 3．HIVJ病毒感染細(xì)胞及病毒嗜性分析 將 HIV叫病毒株以 100TCID50分別感染置于 24孔板培養(yǎng)的濃度為 5 X 10勺Inl的巨噬細(xì)胞、濃度為2 X 10Vrnl MT－2細(xì)胞，并洗掉未感染細(xì)胞的 病毒。以培養(yǎng)上清液中的P24抗原做為病毒生長的評價指標(biāo)，每3天進(jìn)行 一次 P24抗原的檢測，直至 15天，觀察其在巨噬細(xì)胞、MT－2細(xì)胞的細(xì)胞融 ·2· 合及病毒增殖情況。 4．HIV人病毒復(fù)制動力學(xué)的檢測 將＊V入病毒株以 100TCID50感染預(yù)刺激濃度為 IX 10Vml PBMC 細(xì)胞，并洗掉未感染細(xì)胞的病毒。以培養(yǎng)上清液中的廠排抗原做為病毒復(fù) 制動力學(xué)的評價指標(biāo)，每3－4天換培養(yǎng)液一次，每7天換一次預(yù)刺激的 PBMC，每3天進(jìn)行一次P24抗原的檢測并觀察CPE，直至15天。 5．PCR擴(kuò)增 HIV一lenv夕膜基因 V3－VS區(qū) PCR （）DNA提�。和庵芸鼓o脈血快速提取全基因組DNA采用PURE－ GENE試劑盒，將水合后的DNA置一20℃保存?zhèn)溆谩?（2）PCR擴(kuò)增HIV—lenv外膜基因V3－VS區(qū)PCR及前病毒DNA定 量：采用套式 PCR（Nest－PCR，N－PCR）方法擴(kuò)增 HIV－lenv夕膜 V3－VS 區(qū)基因，以EDS／ED12為外側(cè)擴(kuò)增引物進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)；取sgl PCR 產(chǎn)物，以 ES7／ESS為內(nèi)側(cè)引物進(jìn)行第二輪PCR，片段大小為702hp，其中靶 片段為 627bg。HIV一二前病毒拷貝的半定量 PCR是將全基因組的 fun ＊＊A做系列倍比稀釋＊．2、o．05、o．02、o．皿5、o．肋ZUg，然后做N－PC R。 一個陽性 NPCR標(biāo)志著至少一個 HIV一旦前病毒的存在，從而估計出二卜召 全基因組 nwx所含前病
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R373

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 譚建新;HIV-1B'亞型毒株全基因組分子克隆[D];河北大學(xué);2007年

本文編號：2753201