【摘要】：【目的】 1.構(gòu)建能表達(dá)小鼠Ankrd17基因的小發(fā)卡RNAs（shRNAs）慢病毒載體，為選擇性沉默Ankrd17基因在神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）中的表達(dá)奠定基礎(chǔ)； 2.研究神經(jīng)干細(xì)胞Ankrd17基因沉默后MCMV感染對(duì)其增殖、分化功能和凋亡的影響，為明確MCMV致神經(jīng)系統(tǒng)損傷機(jī)制提供新的思路和依據(jù)； 3.研究神經(jīng)干細(xì)胞Ankrd17基因沉默后MCMV感染對(duì)其Wnt信號(hào)通路相關(guān)分化基因表達(dá)的影響，以明確Ankrd17分子與MCMV嗜神經(jīng)蛋白M122的相互作用與胎腦發(fā)育異常機(jī)制的關(guān)系。 【方法】 1.構(gòu)建重組干擾序列載體質(zhì)粒：將含Ankrd17基因siRNA序列的DNAoligo退火形成雙鏈DNAoligo，再將該雙鏈DNAoligo連接到BSAI酶切的pBSilence1.2線性化表達(dá)質(zhì)粒載體上。將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到制備好的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)對(duì)長(zhǎng)出的克隆菌落進(jìn)行提取質(zhì)粒和SacI酶切和測(cè)序鑒定，即得到成功轉(zhuǎn)染的菌株命名為pBSi/U6-Ankrd17； 2.構(gòu)建重組慢病毒載體質(zhì)粒：將正確克隆的質(zhì)粒pBSi/U6-Ankrd17用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染至小鼠源性的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)PCR鑒定篩選有效靶點(diǎn)。根據(jù)篩選的有效靶點(diǎn)基因序列設(shè)計(jì)合成shRNA-Ankrd17片段。通過(guò)將慢病毒載體質(zhì)粒pLVX-shRNA2-m用PstI和BamHI進(jìn)行雙酶切反應(yīng)后，將shRNA-Ankrd17的稀釋退火產(chǎn)物與之連接，構(gòu)建重組慢病毒載體質(zhì)粒pLVX-shRNA-Ankrd17，通過(guò)DNA測(cè)序進(jìn)行鑒定； 3.制備載體慢病毒：在慢病毒包裝系統(tǒng)LentiviralPackingMixture的幫助下將pLVX-shRNA-Ankrd17載體共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，收獲并濃縮所得到的的慢病毒上清，即為最終的慢病毒顆粒（Lenti-Ankrd17shRNA）儲(chǔ)存液，用逐孔稀釋法測(cè)定病毒滴度； 4.檢測(cè)RNAi效率：用Lenti-Ankrd17shRNA慢病毒液感染胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞，通過(guò)熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況來(lái)判斷最適感染條件，并通過(guò)Real-TimePCR檢測(cè)Lenti-Ankrd17shRNA對(duì)NSCs中Ankrd17基因的干擾效率； 5.后續(xù)實(shí)驗(yàn)分組：①慢病毒干擾+MCMV感染組；②MCMV感染對(duì)照組；③慢病毒干擾對(duì)照組；④正常對(duì)照組；每組設(shè)3復(fù)孔； 6.用CCK-8法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞Ankrd17基因沉默后MCMV感染對(duì)其增殖的影響； 7.用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞Ankrd17基因沉默后MCMV感染對(duì)其分化的影響； 8.用PI染色法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞Ankrd17基因沉默后MCMV感染對(duì)其凋亡的影響； 9.用Real-TimePCR方法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞Ankrd17基因沉默后MCMV感染對(duì)其Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因（wnt1,wnt3,wnt7a,ngn1,ngn2,c-myc和cyclinD1）表達(dá)的影響。 【結(jié)果】 1.重組干擾序列載體構(gòu)建：測(cè)序結(jié)果表明，目的基因Ankrd17成功插入到載體質(zhì)粒pBSilence1.2中，成功構(gòu)建pBSi/U6-Ankrd17克隆載體，且與目的序列完全一致； 2.重組慢病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建：PCR反應(yīng)顯示克隆正確的3個(gè)載體質(zhì)粒均可擴(kuò)增出Ankrd17基因產(chǎn)物，通過(guò)Real-TimePCR成功篩選出有效干擾靶點(diǎn)pBS1.2Ankrd17-1載體質(zhì)粒；酶切及測(cè)序結(jié)果表明，成功構(gòu)建重組慢病毒載體質(zhì)粒pLVX-shRNA-Ankrd17，與目的序列完全一致； 3.載體慢病毒制備：成功制備出表達(dá)Ankrd17基因shRNA的慢病毒顆粒濃縮液，病毒滴度為1.0×108TU/mL； 4.選擇性沉默效率：熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，NSCs在轉(zhuǎn)染慢病毒顆粒5d后，在MOI=5并添加5μg/ml的polybrene的轉(zhuǎn)染條件下轉(zhuǎn)染效率最好，Real-TimePCR結(jié)果顯示，與空病毒組和正常細(xì)胞對(duì)照組相比，pLVX-shRNA-Ankrd17-1可以明顯降低NSCs中Ankrd17表達(dá)水平，其沉默效率達(dá)到67.3%； 5.細(xì)胞增殖：與MCMV感染對(duì)照組相比，慢病毒干擾+MCMV感染組的細(xì)胞增殖活性明顯升高（p0.05）； 6.細(xì)胞分化：分化培養(yǎng)3d后，慢病毒干擾組nestin的表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組（p0.05），而GFAP和NSE的陽(yáng)性比率亦明顯低于正常對(duì)照組（p0.05）。而慢病毒干擾+MCMV感染組在分化培養(yǎng)第3d時(shí)，其GFAP和NSE的陽(yáng)性細(xì)胞率明顯高于感染對(duì)照組（p0.05）； 7.細(xì)胞凋亡：MCMV感染組NSCs的凋亡率在感染后第5d明顯高于正常對(duì)照組（p0.05），慢病毒干擾組中在第3d起凋亡率明顯高于正常對(duì)照組（p0.05），而慢病毒干擾+MCMV感染組的細(xì)胞凋亡率始終明顯高于感染對(duì)照組（p0.05）。 8.Wnt基因表達(dá)：在慢病毒干擾組，Wnt1的表達(dá)量在第1d和第3d時(shí)明顯低于正常對(duì)照組，而第5d時(shí)又顯著升高（p0.05），Wnt3和Wnt7a在分化培養(yǎng)第5d時(shí)高于正常對(duì)照組（p0.05）；慢病毒干擾+MCMV感染組的Wnt1表達(dá)則呈逐漸上升趨勢(shì)，在感染后第3d和第5d明顯高于感染對(duì)照組（p0.05），而Wnt3和Wnt7a的表達(dá)從感染后第1d到第5d始終高于感染對(duì)照組（p0.05）。 9.Ngn基因表達(dá)：慢病毒干擾組的Ngn1表達(dá)始終低于正常對(duì)照組，Ngn2基因在第1d和第3d時(shí)表達(dá)水平稍低于正常對(duì)照組，第5d時(shí)則明顯高于正常對(duì)照組（p0.05）；而慢病毒干擾+MCMV感染組的Ngn1表達(dá)卻明顯高于感染對(duì)照組（p0.05），其Ngn2表達(dá)亦始終高于感染對(duì)照組。 10.c-myc和cyclinD1基因表達(dá)：慢病毒干擾組c-myc基因的表達(dá)水平始終低于正常對(duì)照組，cyclinD1在第1d和第3d時(shí)表達(dá)量稍低于正常對(duì)照組，第5d時(shí)開始上升，明顯高于正常對(duì)照組（p0.05）；而在慢病毒干擾+MCMV感染組的c-myc表達(dá)在感染后第3d和第5d顯著高于感染對(duì)照組（p0.05），其cyclinD1基因除在第1d時(shí)稍高于感染對(duì)照組外，在感染后第3d和第5d均低于感染對(duì)照組。 【結(jié)論】 1.成功構(gòu)建了小鼠Ankrd17基因shRNA慢病毒載體pLVX-shRNA-Ankrd17；該慢病毒載體可以有效沉默胎鼠NSCs的Ankrd17基因； 2.選擇性沉默神經(jīng)干細(xì)胞Ankrd17基因后，MCMV感染對(duì)NSCs的增殖活性和早期NSCs分化的抑制程度明顯減弱，并導(dǎo)致NSCs的凋亡比率增高； 3.選擇性沉默神經(jīng)干細(xì)胞Ankrd17基因可部分減輕MCMV誘導(dǎo)的NSCsWnt信號(hào)通路分化相關(guān)基因wnt1，wnt3，wnt7a，ngn1和ngn2以及c-myc的表達(dá)異常，并下調(diào)cyclinD1表達(dá)水平； 4.MCMV嗜神經(jīng)蛋白M122蛋白可通過(guò)與神經(jīng)干細(xì)胞Ankrd17分子相互作用，干擾NSCs的Wnt信號(hào)通路分化相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)而抑制NSCs的增殖和分化，這可能是先天性CMV感染所致胎腦發(fā)育異常的重要機(jī)制之一。 【目的】 研究大蒜新素對(duì)人巨細(xì)胞病毒（HCMV）感染人胚肺成纖維（HELF）細(xì)胞后即刻早期基因、早期基因和晚期基因表達(dá)的影響，探討和明確大蒜新素抗HCMV效應(yīng)的機(jī)制。 【方法】 選擇HCMV在增殖周期中主要表達(dá)即刻早期基因ul123和ul122（分別編碼IE72和IE86蛋白），早期基因ul54（編碼UL54蛋白）和晚期基因ul83（編碼pp65蛋白）作為靶序列設(shè)計(jì)特異性引物，同時(shí)用GAPDH基因作為管家基因，建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)HCMVul122，ul123，ul54和ul83mRNA水平的時(shí)序性動(dòng)態(tài)變化。實(shí)驗(yàn)分組：①大蒜新素處理HCMVAD169毒株（MOI=2.5）感染HELF細(xì)胞組（大蒜新素處理組），大蒜新素劑量為9.6μg/ml（2.28倍IC50濃度）；②HCMVAD169毒株（MOI=2.5）感染HELF細(xì)胞對(duì)照組（HCMV感染對(duì)照組）；③更昔洛韋（GCV）處理HCMVAD169毒株（MOI=2.5）感染HELF細(xì)胞對(duì)照組（GCV處理組），GCV劑量為2.3μg/ml（2.28倍IC50濃度）；正常HELF細(xì)胞為陰性對(duì)照。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)各組細(xì)胞感染后0.5h、2h、4h、6h、12h和24h時(shí)間點(diǎn)HCMV的ul122、ul123、ul54和ul83基因在轉(zhuǎn)錄水平的動(dòng)態(tài)變化。 【結(jié)果】 1.大蒜新素對(duì)HCMVul122基因表達(dá)的影響：HCMVAD169株ul122mRNA在感染后2h表達(dá)量已明顯增高，隨后逐漸增長(zhǎng)。兩種藥物處理組ul122mRNA的表達(dá)量在感染后2h～24h均低于同時(shí)間點(diǎn)病毒感染細(xì)胞組，但GCV處理組在感染后0.5h～24h與病毒對(duì)照組水平相當(dāng)（p0.05）。大蒜新素對(duì)AD169ul122mRNA表達(dá)的抑制率在感染后0.5h～24h各時(shí)間點(diǎn)分別是21.3%，36.1%，40.8%，47.3%，60.2%和75.2%，抑制效應(yīng)在感染后24h最強(qiáng)。 2.大蒜新素對(duì)HCMVul123基因表達(dá)的影響：HCMVul123mRNA的表達(dá)規(guī)律同ul122，在感染后2h表達(dá)量明顯升高，之后持續(xù)增高。大蒜新素處理組ul123的表達(dá)量始終明顯低于感染對(duì)照組（p0.01），且大蒜新素對(duì)ul123mRNA表達(dá)的抑制程度隨時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，在感染后24h抑制率達(dá)到70.4%，而GCV組則與病毒感染組比較無(wú)明顯差異（p0.05）。 3.大蒜新素對(duì)HCMVul54基因表達(dá)的影響：ul54mRNA在感染后4h開始表達(dá)量明顯增多（p0.05），之后持續(xù)增加。兩種藥物處理組ul54mRNA表達(dá)量始終低于病毒對(duì)照組（p0.05）。大蒜新素和GCV對(duì)ul54mRNA表達(dá)的抑制率在感染后24h分別為45.4%和27.2%。 4.大蒜新素對(duì)HCMVul83基因表達(dá)的影響：ul83mRNA在HCMV感染后6h開始表達(dá)明顯增多（p0.05），感染后12h～24h表達(dá)量持續(xù)上升。在感染后12h～24h兩種藥物處理組ul83mRNA表達(dá)量明顯低于病毒對(duì)照組（p0.05），大蒜新素和GCV對(duì)ul83mRNA表達(dá)的抑制率在感染后24h分別為45.9%和26.2%。 【結(jié)論】 1.大蒜新素可顯著抑制HCMVAD169毒株IE基因（ul122和ul123）的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，導(dǎo)致其mRNA表達(dá)明顯降低，抑制率在感染后24h可達(dá)到75.2%和70.4%；對(duì)E基因（ul54）和L基因（ul83）轉(zhuǎn)錄水平亦有所抑制，抑制率在感染后24h分別為45.4%和45.9%，表明HCMV的IE基因可能是大蒜新素抗HCMV作用的主要環(huán)節(jié)。 2.GCV對(duì)HCMVAD169毒株IE基因沒(méi)有明顯的抑制作用，對(duì)ul54和ul83在感染后24h抑制率分別為27.2%和26.2%，表明GCV抗HCMV的作用機(jī)制主要在于抑制病毒DNA聚合酶。 3.大蒜新素和GCV對(duì)HCMVAD169相關(guān)基因的抑制效應(yīng)不同與其作用位點(diǎn)不同有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 方峰;;抗巨細(xì)胞病毒藥物的研究進(jìn)展和臨床應(yīng)用[J];臨床兒科雜志;2007年07期

2 方峰;;兒童巨細(xì)胞病毒性疾病的診斷與防治[J];實(shí)用兒科臨床雜志;2010年10期

3 王慧;劉興樓;舒賽男;張菊;黃永建;方峰;;Murine Cytomegalovirus IE3 Protein Interacts with Ankrd17[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2011年03期

4 北京地區(qū)母嬰巨細(xì)胞病毒感染課題組;李莉;米榮;李鐵耕;徐放生;趙林清;李揚(yáng);張素云;黃醒華;李洋遠(yuǎn);李智;張運(yùn)平;劉曉紅;盧新;張雪峰;周俊杰;劉亞非;崔惠英;呂志蘭;;北京地區(qū)新生兒先天巨細(xì)胞病毒感染狀況研究[J];中國(guó)新生兒科雜志;2012年01期

5 甄宏;方峰;舒賽男;周玉峰;董永綏;聶興草;李革;;大蒜新素抑制人巨細(xì)胞病毒即刻早期基因表達(dá)在抗人巨細(xì)胞病毒機(jī)制中的作用[J];中國(guó)循證兒科雜志;2006年01期

6 羅丹;舒賽男;周玉峰;劉興樓;田佳;王惠;周華;李革;方峰;;鼠巨細(xì)胞病毒影響神經(jīng)干細(xì)胞分化及分化基因的表達(dá)[J];中國(guó)病理生理雜志;2009年11期

7 舒賽男,方峰,董永綏;大蒜新素抑制人巨細(xì)胞病毒即刻早期抗原表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國(guó)中藥雜志;2003年10期

8 周玉峰;方峰;董永綏;周華;甄宏;劉瑾;李革;;小鼠巨細(xì)胞病毒抑制神經(jīng)干細(xì)胞分化及其機(jī)制研究[J];中華兒科雜志;2006年07期

9 方峰,董永綏;巨細(xì)胞病毒和巨細(xì)胞病毒感染的診斷[J];中華兒科雜志;1999年07期

10 許蘭平,郭乃欖,任漢云,高志勇,張耀臣,陳歡,陸道培;異基因造血干細(xì)胞移植后巨細(xì)胞病毒腸炎的臨床分析[J];中華內(nèi)科雜志;2001年08期

本文編號(hào)：2752086