【摘要】：【目的】 1.構(gòu)建能表達小鼠Ankrd17基因的小發(fā)卡RNAs（shRNAs）慢病毒載體，為選擇性沉默Ankrd17基因在神經(jīng)干細胞（NSCs）中的表達奠定基礎； 2.研究神經(jīng)干細胞Ankrd17基因沉默后MCMV感染對其增殖、分化功能和凋亡的影響，為明確MCMV致神經(jīng)系統(tǒng)損傷機制提供新的思路和依據(jù)； 3.研究神經(jīng)干細胞Ankrd17基因沉默后MCMV感染對其Wnt信號通路相關分化基因表達的影響，以明確Ankrd17分子與MCMV嗜神經(jīng)蛋白M122的相互作用與胎腦發(fā)育異常機制的關系。 【方法】 1.構(gòu)建重組干擾序列載體質(zhì)粒：將含Ankrd17基因siRNA序列的DNAoligo退火形成雙鏈DNAoligo，再將該雙鏈DNAoligo連接到BSAI酶切的pBSilence1.2線性化表達質(zhì)粒載體上。將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到制備好的細菌感受態(tài)細胞，通過對長出的克隆菌落進行提取質(zhì)粒和SacI酶切和測序鑒定，即得到成功轉(zhuǎn)染的菌株命名為pBSi/U6-Ankrd17； 2.構(gòu)建重組慢病毒載體質(zhì)粒：將正確克隆的質(zhì)粒pBSi/U6-Ankrd17用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染至小鼠源性的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞，經(jīng)PCR鑒定篩選有效靶點。根據(jù)篩選的有效靶點基因序列設計合成shRNA-Ankrd17片段。通過將慢病毒載體質(zhì)粒pLVX-shRNA2-m用PstI和BamHI進行雙酶切反應后，將shRNA-Ankrd17的稀釋退火產(chǎn)物與之連接，構(gòu)建重組慢病毒載體質(zhì)粒pLVX-shRNA-Ankrd17，通過DNA測序進行鑒定； 3.制備載體慢病毒：在慢病毒包裝系統(tǒng)LentiviralPackingMixture的幫助下將pLVX-shRNA-Ankrd17載體共轉(zhuǎn)染至293T細胞，收獲并濃縮所得到的的慢病毒上清，即為最終的慢病毒顆粒（Lenti-Ankrd17shRNA）儲存液，用逐孔稀釋法測定病毒滴度； 4.檢測RNAi效率：用Lenti-Ankrd17shRNA慢病毒液感染胎鼠神經(jīng)干細胞，通過熒光顯微鏡觀察熒光表達情況來判斷最適感染條件，并通過Real-TimePCR檢測Lenti-Ankrd17shRNA對NSCs中Ankrd17基因的干擾效率； 5.后續(xù)實驗分組：①慢病毒干擾+MCMV感染組；②MCMV感染對照組；③慢病毒干擾對照組；④正常對照組；每組設3復孔； 6.用CCK-8法檢測神經(jīng)干細胞Ankrd17基因沉默后MCMV感染對其增殖的影響； 7.用流式細胞術(shù)檢測神經(jīng)干細胞Ankrd17基因沉默后MCMV感染對其分化的影響； 8.用PI染色法檢測神經(jīng)干細胞Ankrd17基因沉默后MCMV感染對其凋亡的影響； 9.用Real-TimePCR方法檢測神經(jīng)干細胞Ankrd17基因沉默后MCMV感染對其Wnt信號通路相關基因（wnt1,wnt3,wnt7a,ngn1,ngn2,c-myc和cyclinD1）表達的影響。 【結(jié)果】 1.重組干擾序列載體構(gòu)建：測序結(jié)果表明，目的基因Ankrd17成功插入到載體質(zhì)粒pBSilence1.2中，成功構(gòu)建pBSi/U6-Ankrd17克隆載體，且與目的序列完全一致； 2.重組慢病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建：PCR反應顯示克隆正確的3個載體質(zhì)粒均可擴增出Ankrd17基因產(chǎn)物，通過Real-TimePCR成功篩選出有效干擾靶點pBS1.2Ankrd17-1載體質(zhì)粒；酶切及測序結(jié)果表明，成功構(gòu)建重組慢病毒載體質(zhì)粒pLVX-shRNA-Ankrd17，與目的序列完全一致； 3.載體慢病毒制備：成功制備出表達Ankrd17基因shRNA的慢病毒顆粒濃縮液，病毒滴度為1.0×108TU/mL； 4.選擇性沉默效率：熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，NSCs在轉(zhuǎn)染慢病毒顆粒5d后，在MOI=5并添加5μg/ml的polybrene的轉(zhuǎn)染條件下轉(zhuǎn)染效率最好，Real-TimePCR結(jié)果顯示，與空病毒組和正常細胞對照組相比，pLVX-shRNA-Ankrd17-1可以明顯降低NSCs中Ankrd17表達水平，其沉默效率達到67.3%； 5.細胞增殖：與MCMV感染對照組相比，慢病毒干擾+MCMV感染組的細胞增殖活性明顯升高（p0.05）； 6.細胞分化：分化培養(yǎng)3d后，慢病毒干擾組nestin的表達水平明顯高于正常對照組（p0.05），而GFAP和NSE的陽性比率亦明顯低于正常對照組（p0.05）。而慢病毒干擾+MCMV感染組在分化培養(yǎng)第3d時，其GFAP和NSE的陽性細胞率明顯高于感染對照組（p0.05）； 7.細胞凋亡：MCMV感染組NSCs的凋亡率在感染后第5d明顯高于正常對照組（p0.05），慢病毒干擾組中在第3d起凋亡率明顯高于正常對照組（p0.05），而慢病毒干擾+MCMV感染組的細胞凋亡率始終明顯高于感染對照組（p0.05）。 8.Wnt基因表達：在慢病毒干擾組，Wnt1的表達量在第1d和第3d時明顯低于正常對照組，而第5d時又顯著升高（p0.05），Wnt3和Wnt7a在分化培養(yǎng)第5d時高于正常對照組（p0.05）；慢病毒干擾+MCMV感染組的Wnt1表達則呈逐漸上升趨勢，在感染后第3d和第5d明顯高于感染對照組（p0.05），而Wnt3和Wnt7a的表達從感染后第1d到第5d始終高于感染對照組（p0.05）。 9.Ngn基因表達：慢病毒干擾組的Ngn1表達始終低于正常對照組，Ngn2基因在第1d和第3d時表達水平稍低于正常對照組，第5d時則明顯高于正常對照組（p0.05）；而慢病毒干擾+MCMV感染組的Ngn1表達卻明顯高于感染對照組（p0.05），其Ngn2表達亦始終高于感染對照組。 10.c-myc和cyclinD1基因表達：慢病毒干擾組c-myc基因的表達水平始終低于正常對照組，cyclinD1在第1d和第3d時表達量稍低于正常對照組，第5d時開始上升，明顯高于正常對照組（p0.05）；而在慢病毒干擾+MCMV感染組的c-myc表達在感染后第3d和第5d顯著高于感染對照組（p0.05），其cyclinD1基因除在第1d時稍高于感染對照組外，在感染后第3d和第5d均低于感染對照組。 【結(jié)論】 1.成功構(gòu)建了小鼠Ankrd17基因shRNA慢病毒載體pLVX-shRNA-Ankrd17；該慢病毒載體可以有效沉默胎鼠NSCs的Ankrd17基因； 2.選擇性沉默神經(jīng)干細胞Ankrd17基因后，MCMV感染對NSCs的增殖活性和早期NSCs分化的抑制程度明顯減弱，并導致NSCs的凋亡比率增高； 3.選擇性沉默神經(jīng)干細胞Ankrd17基因可部分減輕MCMV誘導的NSCsWnt信號通路分化相關基因wnt1，wnt3，wnt7a，ngn1和ngn2以及c-myc的表達異常，并下調(diào)cyclinD1表達水平； 4.MCMV嗜神經(jīng)蛋白M122蛋白可通過與神經(jīng)干細胞Ankrd17分子相互作用，干擾NSCs的Wnt信號通路分化相關基因表達進而抑制NSCs的增殖和分化，這可能是先天性CMV感染所致胎腦發(fā)育異常的重要機制之一。 【目的】 研究大蒜新素對人巨細胞病毒（HCMV）感染人胚肺成纖維（HELF）細胞后即刻早期基因、早期基因和晚期基因表達的影響，探討和明確大蒜新素抗HCMV效應的機制。 【方法】 選擇HCMV在增殖周期中主要表達即刻早期基因ul123和ul122（分別編碼IE72和IE86蛋白），早期基因ul54（編碼UL54蛋白）和晚期基因ul83（編碼pp65蛋白）作為靶序列設計特異性引物，同時用GAPDH基因作為管家基因，建立實時熒光定量PCR系統(tǒng)來檢測HCMVul122，ul123，ul54和ul83mRNA水平的時序性動態(tài)變化。實驗分組：①大蒜新素處理HCMVAD169毒株（MOI=2.5）感染HELF細胞組（大蒜新素處理組），大蒜新素劑量為9.6μg/ml（2.28倍IC50濃度）；②HCMVAD169毒株（MOI=2.5）感染HELF細胞對照組（HCMV感染對照組）；③更昔洛韋（GCV）處理HCMVAD169毒株（MOI=2.5）感染HELF細胞對照組（GCV處理組），GCV劑量為2.3μg/ml（2.28倍IC50濃度）；正常HELF細胞為陰性對照。用實時熒光定量PCR方法檢測各組細胞感染后0.5h、2h、4h、6h、12h和24h時間點HCMV的ul122、ul123、ul54和ul83基因在轉(zhuǎn)錄水平的動態(tài)變化。 【結(jié)果】 1.大蒜新素對HCMVul122基因表達的影響：HCMVAD169株ul122mRNA在感染后2h表達量已明顯增高，隨后逐漸增長。兩種藥物處理組ul122mRNA的表達量在感染后2h～24h均低于同時間點病毒感染細胞組，但GCV處理組在感染后0.5h～24h與病毒對照組水平相當（p0.05）。大蒜新素對AD169ul122mRNA表達的抑制率在感染后0.5h～24h各時間點分別是21.3%，36.1%，40.8%，47.3%，60.2%和75.2%，抑制效應在感染后24h最強。 2.大蒜新素對HCMVul123基因表達的影響：HCMVul123mRNA的表達規(guī)律同ul122，在感染后2h表達量明顯升高，之后持續(xù)增高。大蒜新素處理組ul123的表達量始終明顯低于感染對照組（p0.01），且大蒜新素對ul123mRNA表達的抑制程度隨時間延長而增強，在感染后24h抑制率達到70.4%，而GCV組則與病毒感染組比較無明顯差異（p0.05）。 3.大蒜新素對HCMVul54基因表達的影響：ul54mRNA在感染后4h開始表達量明顯增多（p0.05），之后持續(xù)增加。兩種藥物處理組ul54mRNA表達量始終低于病毒對照組（p0.05）。大蒜新素和GCV對ul54mRNA表達的抑制率在感染后24h分別為45.4%和27.2%。 4.大蒜新素對HCMVul83基因表達的影響：ul83mRNA在HCMV感染后6h開始表達明顯增多（p0.05），感染后12h～24h表達量持續(xù)上升。在感染后12h～24h兩種藥物處理組ul83mRNA表達量明顯低于病毒對照組（p0.05），大蒜新素和GCV對ul83mRNA表達的抑制率在感染后24h分別為45.9%和26.2%。 【結(jié)論】 1.大蒜新素可顯著抑制HCMVAD169毒株IE基因（ul122和ul123）的轉(zhuǎn)錄過程，導致其mRNA表達明顯降低，抑制率在感染后24h可達到75.2%和70.4%；對E基因（ul54）和L基因（ul83）轉(zhuǎn)錄水平亦有所抑制，抑制率在感染后24h分別為45.4%和45.9%，表明HCMV的IE基因可能是大蒜新素抗HCMV作用的主要環(huán)節(jié)。 2.GCV對HCMVAD169毒株IE基因沒有明顯的抑制作用，對ul54和ul83在感染后24h抑制率分別為27.2%和26.2%，表明GCV抗HCMV的作用機制主要在于抑制病毒DNA聚合酶。 3.大蒜新素和GCV對HCMVAD169相關基因的抑制效應不同與其作用位點不同有關。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 方峰;;抗巨細胞病毒藥物的研究進展和臨床應用[J];臨床兒科雜志;2007年07期

2 方峰;;兒童巨細胞病毒性疾病的診斷與防治[J];實用兒科臨床雜志;2010年10期

3 王慧;劉興樓;舒賽男;張菊;黃永建;方峰;;Murine Cytomegalovirus IE3 Protein Interacts with Ankrd17[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2011年03期

4 北京地區(qū)母嬰巨細胞病毒感染課題組;李莉;米榮;李鐵耕;徐放生;趙林清;李揚;張素云;黃醒華;李洋遠;李智;張運平;劉曉紅;盧新;張雪峰;周俊杰;劉亞非;崔惠英;呂志蘭;;北京地區(qū)新生兒先天巨細胞病毒感染狀況研究[J];中國新生兒科雜志;2012年01期

5 甄宏;方峰;舒賽男;周玉峰;董永綏;聶興草;李革;;大蒜新素抑制人巨細胞病毒即刻早期基因表達在抗人巨細胞病毒機制中的作用[J];中國循證兒科雜志;2006年01期

6 羅丹;舒賽男;周玉峰;劉興樓;田佳;王惠;周華;李革;方峰;;鼠巨細胞病毒影響神經(jīng)干細胞分化及分化基因的表達[J];中國病理生理雜志;2009年11期

7 舒賽男,方峰,董永綏;大蒜新素抑制人巨細胞病毒即刻早期抗原表達的實驗研究[J];中國中藥雜志;2003年10期

8 周玉峰;方峰;董永綏;周華;甄宏;劉瑾;李革;;小鼠巨細胞病毒抑制神經(jīng)干細胞分化及其機制研究[J];中華兒科雜志;2006年07期

9 方峰,董永綏;巨細胞病毒和巨細胞病毒感染的診斷[J];中華兒科雜志;1999年07期

10 許蘭平,郭乃欖,任漢云,高志勇,張耀臣,陳歡,陸道培;異基因造血干細胞移植后巨細胞病毒腸炎的臨床分析[J];中華內(nèi)科雜志;2001年08期

本文編號：2752086