【摘要】：瘧疾仍是目前世界上嚴重影響人類健康的傳染病。瘧原蟲抗藥性的產(chǎn)生和 迅速擴散以及抗殺蟲劑蚊媒的出現(xiàn)和蔓延迫切需要我們尋求新的瘧疾防治措施。 發(fā)展有效的瘧疾疫苗是人類控制乃至消滅瘧疾的重要途徑。惡性瘧原蟲主要裂殖 子表面蛋白1（PfMSP1）是當(dāng)今領(lǐng)先的瘧疾疫苗候選抗原，其主要實驗依據(jù)是 來自夜猴攻擊試驗。用純化的MSP1天然蛋白免疫的夜猴能部分或完全保護后來 同種瘧原蟲的攻擊感染。MSP1特異單抗或多抗能在體外有效抑制瘧原蟲的生長。 PfMSP1是分子量為185-200KD的糖蛋白，它在裂體增殖時合成，并在裂殖體破 裂時被酶解為 4個片段，按其分子量大小分別定名為 MSP1-83、MSP1-31、 MSP1-36和 MSP1-42。FCB株 5kb Pfmsp1基因及其 4個酶解片段基因的人工全 合成（選用人密碼子）克服了天然 Pfmsp1基因因 A＋T含量異常高（74％）而導(dǎo)致其 在異源系統(tǒng)中極不穩(wěn)定的困難。研究表明，PfMSP1的免疫保護作用依賴該蛋白 正確構(gòu)象的形成，本研究開展了在畢氏酵母系統(tǒng)中表達全長 PfMSP1及其酶解片 段，并進行免疫保護作用的研究，取得了以下結(jié)果： 1．將 FCB株 5kb PfMSP1全合成基因進行改造，去樣其 5’端信號肽序列， 增設(shè)起始密碼 ATG和兩端用于克隆的BamHI和 NotⅠ切點序列。改造的 PfMSP1 基因與 pPIC3．5載體連接后轉(zhuǎn)入畢氏酵母 SMD1168中進行胞內(nèi)表達。結(jié)果顯示， 全長PfMSP1基因在該系統(tǒng)中獲得表達，用mAb5．2單抗進行免疫印跡法檢測， 在經(jīng)甲醇誘導(dǎo)的樣品中出現(xiàn)約200KD的表達條帶，而在未誘導(dǎo)和陰性對照中無 特異條帶出現(xiàn)。用mAb5．2單抗的親和層析柱能純化到表達產(chǎn)物，但因胞內(nèi)表達 且產(chǎn)量低，故制備足夠蛋白進行免疫學(xué)試驗仍有相當(dāng)困難。 2．為弄清 PfMSP1各酶解片段的免疫保護作用，鑒定出有保護作用的片段 以代替全長蛋白用于疫苗試驗，我們開展了在畢氏酵母中表達 PfMSP1各酶解片 段的研究。將4個片段分別插入經(jīng)改建的pPICZa表達載體中，轉(zhuǎn)入畢氏酵母 SMD1168株進行誘導(dǎo)分泌表達。結(jié)果顯示，MSP1-42能分泌在培養(yǎng)上清，但表達 產(chǎn)物為雙帶。盡管進行大量篩選和培養(yǎng)條件的優(yōu)化。均未能檢測到其余3個酶解 片段的表達。為了解在該系統(tǒng)中產(chǎn)生的MSP1-42重組蛋白的構(gòu)象，我們15個特 異單抗與該蛋白反應(yīng)，其中10個單抗識別構(gòu)象表位。結(jié)果顯示，除2個陰性對 照單抗外，其余13個單抗均能與MSPI葉2反應(yīng)，有3個單抗u．8，13．l和7．3） 不能與＊ 細胞產(chǎn)生的 MSP反應(yīng)，但能畢氏酵母產(chǎn)生的蛋白反應(yīng)，這表明在該 系統(tǒng)中產(chǎn)生的MSPI－42在構(gòu)象上更接近天然蛋白。 3．將上述 MSP42重組蛋白與福氏佐劑乳化后免疫家兔，經(jīng) 4次皮下注射 后，其免疫血清中產(chǎn)生了特異抗體。用培養(yǎng)惡性瘧原蟲為抗原進行間接熒光抗體 試驗，兩只免疫家兔的抗體滴度分別1：2048和1：5 12。用蛋白A柱從免疫血 清中分離總IgG，并檢測該抗體對瘧原蟲體外生長的抑制作用。結(jié)果表明，佐劑 對照組的IgG無任何抑制惡性瘧原蟲生長的作用，但免疫組IgG顯著抑制瘧原蟲 生長，且抑制作用隨 IgG濃度增加而增強，在 250 u g加l時，兩只家兔互妒的抑 O 抑率分別為96．6洲和85．54％。 4．以上結(jié)果顯示了 MSP －42能在畢氏酵母中分泌表達，且能形成天然構(gòu)象， 其特異抗體能抑制瘧原蟲生長。但該序列來自FCB株，目前用于疫苗研究，特 別是進行人體攻擊試驗的標(biāo)準(zhǔn)株為 3D7株。本研究結(jié)果顯示 3D7株 MSP＊2天 然基因不能在畢氏酵母中分泌表達。對此，我們選用畢氏酵母的密碼子，重新設(shè) 計該基因序列，并去掉其中糖基化位點，產(chǎn)生 1202hP 3D，株MSP142全合成基 因。采用不對稱 PCR法全合成該基因。該合成 MSP．42基因能在畢氏酵母中高 水平表達，表達產(chǎn)物為一條帶，無降解產(chǎn)物出現(xiàn)。該重組蛋白也能與識別構(gòu)象表 o 位的單抗反應(yīng)。該表達菌株 15工罐發(fā)酵及純化工作正在進行中，大量制備 3D， 株 MSP＊2重組蛋白為我們開展該抗原的免疫學(xué)研究及疫苗有效性試驗提供有 用的材料
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類號】：R382.31

【引證文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 牛禾;梅氏新貝尼登蟲卵黃鐵蛋白基因的克隆及表達[D];寧波大學(xué);2009年

本文編號：2750668