【摘要】：免疫應(yīng)答是機(jī)體識(shí)別并清除“非我”的重要手段,當(dāng)且僅當(dāng)免疫應(yīng)答強(qiáng)度控制在一定范圍內(nèi)才能有效清除病原微生物并維持自身穩(wěn)態(tài)。本課題圍繞著“表觀分子HAT1的天然免疫功能研究”和"Siglec-G分子在病毒感染中負(fù)向調(diào)控I型干擾素產(chǎn)生的機(jī)制研究”兩部分展開,以進(jìn)一步加深我們對(duì)免疫調(diào)節(jié)與免疫交叉調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí),和對(duì)病毒感染性疾病和自身免疫性疾病的預(yù)防和診療提供新思路。 第一部分B型乙酰轉(zhuǎn)移酶HATl負(fù)向調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及其機(jī)制的研究 組蛋白的乙�；�-去乙�；^程調(diào)節(jié)著眾多生命活動(dòng),不同位點(diǎn)的乙酰化狀態(tài),不論單一還是混合的,將產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。新生組蛋白的乙�；揎桯4K5Ac、H4K8Ac和H4K12Ac被認(rèn)為與核小體的組裝成熟密切相關(guān),而染色質(zhì)中H4K16、H3K56的乙�；蛉ヒ阴；瘎t與基因的轉(zhuǎn)錄活化或沉默息息相關(guān)。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶主要由A型乙�；D(zhuǎn)移酶和B型乙�；D(zhuǎn)移酶兩類構(gòu)成,前者包括GNAT家族、MYST家族、P300/CBP等,主要分布于細(xì)胞核內(nèi),后者主要包含組蛋白H4/H3乙酰轉(zhuǎn)移酶1(Histone acetyltransferases, HAT1),其廣泛分布于在胞漿,少量分布于核內(nèi)；組蛋白去乙�；缚纱致苑譃閮蓚�(gè)大組分,HDAC1至HDAC11、SIRT1至SIRT7。然而,乙�；�-去乙�；揎椩谔烊幻庖邞�(yīng)答過程中的功能尚不清楚。在小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中通過干擾RNA技術(shù)篩選我們發(fā)現(xiàn),HAT1能負(fù)向調(diào)控TLR4信號(hào)所介導(dǎo)的白介素6(interleukin6, IL-6)的產(chǎn)生。這完全出乎我們的意料,需要進(jìn)一步驗(yàn)證上述篩選結(jié)果。HAT1干擾后的小鼠巨噬細(xì)胞,經(jīng)各種病原體刺激后,包括PolyI:C、LPS、CpG-ODN刺激以及RNA病毒SeV和DNA病毒HSV-1感染,所誘導(dǎo)表達(dá)的炎癥細(xì)胞因子IL-6和TNFα mRNA和蛋白水平均顯著高于對(duì)照組,而I型干擾素表達(dá)相對(duì)不受影響。全細(xì)胞蛋白裂解液和胞漿胞核蛋白分離的免疫印跡實(shí)驗(yàn)提示,干擾后的腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)經(jīng)典的MAPK信號(hào)和NF-κB信號(hào)基本沒有改變。究竟是什么原因?qū)е铝薍AT1干擾后IL-6選擇性上調(diào)呢?利用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn),HAT1干擾后小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-6啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3K4Me3和H3Ac水平明顯升高。于是我們提出了可能的機(jī)制猜想：1、B型乙酰轉(zhuǎn)移酶可能和A型乙酰轉(zhuǎn)移酶存在相互競爭,包括組蛋白的相同或相鄰位點(diǎn)的修飾；2、HAT1可能選擇性靶向到某種免疫抑制分子的啟動(dòng)子區(qū),即干擾后存在“負(fù)負(fù)得正”的現(xiàn)象；3、HAT1很可能存在與炎癥密切相關(guān)的非組蛋白底物,直接參與該底物活性調(diào)節(jié)。后續(xù)將深入機(jī)制研究,并在動(dòng)物模型上觀察HAT1在天然免疫應(yīng)答過程中的作用,以期為自身免疫性疾病的預(yù)防和診療提供理論保障和技術(shù)支持。 第二部分Siglec-G負(fù)向調(diào)控RIG-Ⅰ介導(dǎo)IFNβ產(chǎn)生的分子機(jī)制研究 RIG-Ⅰ分子被公認(rèn)為胞漿RNA病毒識(shí)別的關(guān)鍵Sensor,由N端兩個(gè)caspase活化與募集結(jié)構(gòu)域(Caspase activation and recruitment domain, CARDs)、中間的含有DEAD基序的解旋酶/ATP酶結(jié)構(gòu)域(DEAD Helicase/ATPase domain)和C端自我抑制結(jié)構(gòu)域(C-terminal regulatory domain, CTD)共同構(gòu)成,可識(shí)別短于lkb的雙鏈RNA和5'三磷酸RNA。在靜息時(shí),RIG-Ⅰ處于閉合態(tài),即CTD覆蓋著CARDs,當(dāng)外源性短鏈dsRNA進(jìn)入到胞漿后,CTD打開并和解旋酶結(jié)構(gòu)域一起識(shí)別、結(jié)合RNA,使得CARDs結(jié)構(gòu)域暴露,親和下游接頭分子MAVS (Mitochondrial antiviral signaling)上CARDs發(fā)生寡聚化并形成朊蛋白樣結(jié)構(gòu),進(jìn)而活化Ⅰ型干擾素表達(dá)。 為了進(jìn)一步研究RIG-Ⅰ-MAVS-IFNβ信號(hào)通路的調(diào)控,尤其是RIG-Ⅰ翻譯后修飾,我們研究團(tuán)隊(duì)前期進(jìn)行了小鼠原代巨噬細(xì)胞RNA病毒VSV感染模型基因芯片測序分析,和HEK293細(xì)胞RIG-Ⅰ過表達(dá)后免疫沉淀-RIG-Ⅰ蛋白復(fù)合體-質(zhì)譜分析,然后結(jié)合小鼠體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)并證實(shí)唾液酸結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素分子Siglec-G能負(fù)向調(diào)控IFNβ的產(chǎn)生；Siglec-G敲除的腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)RNA病毒誘導(dǎo)后能產(chǎn)生更多的RIG-Ⅰ蛋白(RIG-Ⅰ半衰期被延長了),而接頭分子MAVS表達(dá)相對(duì)恒定。即在RNA病毒感染下,Siglec-G能促進(jìn)RIG-Ⅰ的降解。接下來,本課題對(duì)其中的分子機(jī)制進(jìn)行了深入的探究。我們利用預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果"Siglec-G通過胞內(nèi)段ITIM基序在病毒感染下能招募更多的SHP2分子”而“SHP2在一定條件下能和c-Cbl相互作用,并能降解部分受體酪氨酸激酶(RTKs)",推測c-Cbl可能是RIG-Ⅰ的E3連接酶。原代巨噬細(xì)胞中c-Cbl的干擾的確能增加IFNβ的表達(dá)；]HEK293T重建實(shí)驗(yàn)也證實(shí)c-Cbl能促進(jìn)RIG-Ⅰ發(fā)生K48多聚泛素化而降解。SHP2敲除的巨噬細(xì)胞VSV感染中,干擾了Siglec-G不影響IFN β產(chǎn)生,但干擾了c-Cbl卻能顯著上調(diào)IFN β產(chǎn)生,從而明確了Siglec-G-SHP2-c-Cbl-RIG-I通路的上下游順序。免疫共沉淀和免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)表明,Siglec-G-SHP2-c-Cbl-RIG-I四聚體客觀存在于小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、RAW264.7和HEK293T細(xì)胞中,其中RIG-I的CTD結(jié)構(gòu)域?yàn)閏-Cbl相互作用所必需。為了進(jìn)一步明確c-Cbl靶向降解RIG-Ⅰ的位點(diǎn),我們構(gòu)建了一系列的RIG-Ⅰ點(diǎn)突變,當(dāng)RIG-I第813位賴氨酸突變?yōu)榫彼岷?則具備了抵抗c-Cbl K48位泛素化降解的功能。將RIG-Ⅰ K813R和WT質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞中,熒光報(bào)告基因結(jié)果顯示,K813R更能誘發(fā)IFNβ活化,接著將上述質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)染入RIG-Ⅰ敲除的腹腔巨噬細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)813位點(diǎn)點(diǎn)突變后IFNβ mRNA產(chǎn)生水平相對(duì)更高。綜上所述,RNA病毒能誘導(dǎo)上調(diào)Siglec-G分子招募接頭分子SHP2和E3連接酶c-Cbl,靶向RIG-Ⅰ賴氨酸813位發(fā)生K48泛素化修飾將其降解,減少了IFN-β產(chǎn)生從而實(shí)現(xiàn)RNA病毒自身的逃逸。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

圖1.3.1 HATl能負(fù)向調(diào)控巨嗟細(xì)胞TLR4信號(hào)介導(dǎo)的炎癥因子IL-6產(chǎn)生Figure 1.3.1 HATl negatively regulates TLR4-triggered IL6 expression inmacrophages.(A) Q-PCR analysis of IL-6 mRNA expression in mouse primary peritoneal

圖1.3.2 HATl能負(fù)向調(diào)控多種病原體所誘導(dǎo)的炎癥因子IL-6產(chǎn)生Figurel. 3.2 HATl negatively regulates PRRs-triggered IL-6 expression inmacrophages(A)-(D) ELISA of IL-6，TNF a and IFN 3 in supematants of mouse primaryperitoneal macrophages(5x 10^) 48 hr after transfection with Control siRNA or HATlsiRNA(40nM)，treated by PolyI;C(20 m g/ml) or CpG(l (a M) , or SeV(MOI=0.01), orHSV-1(M0I=1), for indicated time. Similar results were obtained in 3 independentexperiments. Data are shown as mean 土 SD of three independent experiments. *p <0.05 and **p < 0.0116

HSV-1圖1.3.IS HATl能負(fù)向調(diào)控多種病原體所誘導(dǎo)的炎癥因子IL-6產(chǎn)生Figurel.3.1S HATl negatively regulates PRRs-triggered IL6 expression inmacrophages.(A)-(D) Q-PCR analysis of IL-6, TNF a and IFN P mRNA expression of mouseprimary peritoneal macrophages(5 x 10^) 48 hr after transfection with Control siRNA orHATl siRNA(40nM), treated by 20 ju g/ml PolyI:C(A) or 1 ja M CpG(B)，orM01=0.01 SeV(C)，or M0I=1 HSV-l(D)，for indicated time. Similar results wereobtained in 3 independent experiments. Data are shown as mean 土 SD of threeindependent experiments. *p < 0.05 and < 0.0117

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6 Mara Rossini;黃海根;;基因轉(zhuǎn)移小鼠在免疫應(yīng)答研究中的應(yīng)用[J];上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué);1991年01期

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4 解放軍302醫(yī)院肝病生物治療研究中心 王福生 整理 黃顯斌 洪建國;免疫應(yīng)答 乙肝轉(zhuǎn)歸的重要影響因素[N];健康報(bào);2012年

5 梁斌;生豬免疫八忌[N];云南科技報(bào);2008年

6 ;使用疫苗注意事項(xiàng)[N];中國畜牧獸醫(yī)報(bào);2007年

7 廖楊;如何使疫苗免疫達(dá)到最佳效果[N];山東科技報(bào);2008年

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3 李s

本文編號(hào)：2750144